前列腺癌组织中miR-34b、Cyclin D1 mRNA表达变化及其意义

邱忠凯，谭淼，梁伟，丁全明，满晓军

(1本溪市中心医院，辽宁本溪 117000；2中国医科大学附属第一医院)

近年来，我国前列腺癌(PCa)发病率和病死率有逐渐增高的趋势，2015年我国男性PCa的发病率为6.03/1万例，病死率为2.66/1万例[1]，严重危害我国男性尤其是老年男性健康。晚期转移性PCa及去势抵抗PCa病死率较高，因而有必要进一步研究PCa的病因及发生发展机制[2]。miRNA-34家族是不同物种间高度保守的家族，该家族成员包括miR-34a、miR-34b、miR-34c，miR-34a位于染色体1p36，而miR-34b和miR-34c位于11号染色体长臂2区3带(11q23)。研究[3]表明，miR-34家族可通过调节B细胞淋巴瘤(Bcl-2)、c-Met等下游靶基因的表达，发挥抑制肿瘤细胞的作用。miR-34b和miR-34c为同源基因，但因靶基因的不同而发挥不同的调节作用，miR-34b在肿瘤发生发展中的具体作用还有待进一步研究[4]。D型细胞周期蛋白家族由细胞周期蛋白(Cyclin)D1、D2、D3三种蛋白组成，具有调节增殖细胞的G1/S期转变的作用。Cyclin D1过度表达主要与人类肿瘤发生和细胞转移有关，其异常表达在PCa、甲状旁腺腺瘤、乳腺癌、结肠癌、淋巴瘤、黑色素瘤等多种肿瘤发生发展中起关键作用。体外细胞实验中，Cyclin D1的过表达使进入S期的人前列腺癌细胞(LNCaP)数量增多，增加了肿瘤细胞集落形成和肿瘤生长速率[5]。目前，Cyclin D1、miR-34b在PCa中的调控机制及二者之间的关系尚不清楚，需进一步深入研究。本研究通过检测PCA组织中miR-34b、Cyclin D1 mRNA，分析两者间及与PCA临床病理特征的关系，并探讨其临床意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2012年1月～2015 年1月本溪市中心医院收治的PCa患者57例，年龄56～79(67.54±7.80)岁，其中≤65岁24例、>65岁33例。所有患者为初次诊断，未接受其他治疗，并排除其他恶性肿瘤。参照《中国泌尿外科疾病诊断治疗指南》推荐的标准[6]，其中Gleason评分≤6分25例、≥7分32例。临床分期参照美国癌症联合会(AJCC)PCa TNM分期系统[7]，其中Ⅰ～Ⅱ期 26例、Ⅲ～Ⅳ期31例。初始血清PSA≤10 ng/mL 9例，10～20 ng/mL 27例，>20 ng/mL 21例。所有患者术前均检测血碱性磷酸酶、X线、MRI、核素骨扫描等检查以明确有无远处转移，其中有转移15例、无转移42例。PCa组患者术后随访时间3～36个月，平均随访33.4个月，以门诊或电子通讯方式，定期直肠指检、血清总PSA、B超及MRI等检查，随访至随访时间结束或患者死亡，随访截止时间2018年1月1日。另选43例BPH患者作对照，年龄57～79(69.57±6.92)岁。手术切取PCa组织及癌旁正常的前列腺组织各57例份(46例标本行PCa根治术获得，11例行经尿道肿瘤电切获得)及BPH组织43例份(行耻骨上前列腺摘除术获得)。本研究经本院医学伦理委员会批准通过，所有患者知情同意并签字。

1.2 组织中miR-34b、Cyclin D1 mRNA检测方法 采用RT-PCR法。将刚离体的PCa组织、癌旁组织及BPH组织置于液氮速冻，后转运至-80 ℃冰箱保存。细胞中总RNA应用TRIzol法提取。以3 μL总RNA为模板，用TaqMan逆转录试剂盒(ABI)进行逆转录合成cDNA，反应条件如下：16 ℃、30 min，42 ℃、30 min，85 ℃、5 min。miR-34b：5′-TTTTTATTTGTTTTGTTTTGTGTTTGTTTTG-3′，5′-CAACTACAACTCCCAAACAATCC-3′；内参基因U6：5′-

GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，3′-CGCTTCACG-

AATTTGCGTGTCAT-5′；Cyclin D1：5′-GATACCAGAAGGGAAAGC-3′，5′-ATGCCTAGAACCCCACTA-3′。RT-PCR总反应体系为20 μL，其中含1 μL cDNA，1 μL引物，8 μL Power SYBR Green Master Mix试剂、去离子纯水。反应条件为：95 ℃、3 min，95 ℃、30 s，60 ℃、30 s，40个循环。所有反应均在ABI7500 PCR仪上完成，每个样本重复3次。miRNA-34b及Cyclin D1反转录引物、PCR引物、探针、Power SYBR Green Master Mix试剂及ABI7500 RT-PCR仪均购自ABI生物公司。以2-ΔΔCt代表目的基因的相对表达量，计算公式为ΔCt=Ct目的基因-CtU6，ΔΔCt=ΔCt癌组织-ΔCt癌旁组织。

2 结果

2.1 PCa和BPH组织中miR-34b、Cyclin D1 mRNA表达比较 PCa和BPH组织中miR-34b mRNA相对表达量分别为0.57±0.35、1.24±0.48，Cyclin D1 mRNA相对表达量分别为2.72±0.47、0.94±0.21，两组比较，P均<0.05。

2.2 miR-34b、Cyclin D1表达与PCa临床病理特征的关系 结果见表1。

2.3 PCa组织中miR-34b与Cyclin D1表达的相关性 PCa组织中miR-34b与Cyclin D1表达呈负相关(r=-0.517，P=0.013)。

表1 miR-34b、Cyclin D1表达与PCa患者临床病理特征的关系

注：由表1可知，miR-34b、Cyclin D1表达均与Pca患者Gleason评分、TNM分期有关(P均<0.05)。

2.4 组织中不同miR-34b、Cyclin D1表达患者3年总体生存率(OS)比较 所有PCa组织中miR-34b mRNA相对表达量以中位数(P50)0.562为临界值，分为miR-34b高表达组24例，miR-34b低表达组33例；Cyclin D1 mRNA相对表达量以中位数(P50)2.705为临界值，分为Cyclin D1高表达组31例和低Cyclin D1表达组26例。miR-34b高表达组、miR-34b低表达组3年OS分别为83.3%(20/24)、72.7%(24/33)，Cyclin D1高表达组、Cyclin D1低表达组3年OS分别为70.9%(22/31)、84.6%(22/26)，两组比较，P均<0.05。

3 讨论

PCa是泌尿生殖系统常见的恶性肿瘤，近年来随着人口老龄化及饮食结构的改变，其发病率有逐渐升高的趋势，严重威胁男性健康。目前，PCa的治疗包括手术、内分泌治疗及化疗等，但复发和转移性PCa患者的生存率较低。因此，深入研究其发生发展的机制具有重要意义。

miRNA是非编码的单链RNA分子，可通过与目的基因的mRNA的3′-非翻译区结合，形成RNA诱导的沉默复合物，影响mRNA的稳定性影响翻译过程。在许多肿瘤如乳腺癌、肝癌等肿瘤均存在多种miRNA异常表达现象，参与肿瘤增殖、凋亡、分化等病理生理学过程，因此研究其表达有助于肿瘤的诊断、治疗方式选择及判断预后[8]。miR-34基因位于23号染色体，在乳腺癌、非小细胞肺癌、肝细胞癌等多种肿瘤中均表达下调，下调机制与基因启动子区甲基化有关[9]。本研究显示，PCa组织中miR-34b表达下调，此结果与以往研究[10]结果一致，机制可能与miR-34b基因位点11q23杂合性缺失有关，也可能与表观遗传学修饰后基因失活有关[11]。本研究还显示，miR-34b表达与PCa病理分级、分期有关，机制可能与p53蛋白对miR-34表达的调节作用有关，p53基因突变及缺失多发生于高级别、进展期PCa中[12]，p53基因异常表达引起miR-34表达下调，进而miR-34下游靶基因如Bcl-2、c-Met及Sox-2等功能改变，最终导致肿瘤细胞的增殖、浸润及转移，而在低分期，低级别PCa中miR-34表达下降不明显。此外，miR-34b高表达组患者3年总体生存较高，结果表明高表达miR-34b组患者预后较好，可能与miR-34b的抑癌作用有关。

在人类许多肿瘤均发现细胞周期蛋白D基因扩增以及其编码的蛋白质的过表达的现象，细胞周期蛋白表达或细胞周期蛋白激酶(CDK)活化的失调会导致肿瘤的生物学特征的改变。Cyclin D1位于11q13，作为重要的周期素家族成员，参与G1/S期转换调节过程。本研究显示，PCa组织中Cyclin D1表达上调，其机制可能与Cyclin D1原癌基因拷贝数目扩增、基因突变有关。体外实验研究表明，沉默Cyclin D1基因表达能抑制PCa细胞的增殖[13]，而Cyclin D1过表达促进雄激素依赖性PCa细胞的增殖[14]。本研究还显示，Cyclin D1表达与Pca病理分级、分期有关，机制可能是D型细胞周期蛋白(D1、D2和D3)的转录、翻译和蛋白质降解受生长因子激活和整合素衍生的黏附信号传导影响，Cyclin D1高表达会增加肿瘤细胞的侵袭性和转移性，所以增殖、分化和黏附信号与细胞周期进程相统一的过程[15]。Cyclin D1在肿瘤细胞的侵袭、迁移过程中发挥重要作用，体外实验中Cyclin D1高表达可提高PCa细胞的侵袭、迁移和转移能力[16]。此外，Cyclin D1高表达组患者3年OS较低，表明高Cyclin D1表达患者预后不良，可能与高表达组患者分期、分级较高有关。

多种miRNA如miR-195、MiR-218等能够调节肿瘤细胞中Cyclin D1基因表达，进而影响肿瘤细胞增殖、侵袭转移及凋亡[17]。本研究显示，PCa组织中miR-34b mRNA与Cyclin D1 mRNA表达呈负相关，与结果与以往对miR34研究结果一致，其相互作用的机制可能是miR-34能与Cyclin D1和E2、CDK4和6以及其他调节细胞周期基因的mRNA相互作用，调控细胞增殖过程，当miR-34b表达降低时，肿瘤细胞倍增时间缩短，增殖加快。

总之，PCa组织中miR-34b及Cyclin D1 mRNA均存在异常表达现象，与PCa的发生发展有关，有希望成为PCa诊断、治疗及评估预后的新的生物学标志。