肺癌耐顺铂细胞A549/CIS产生肿瘤干细胞特性的分子机制研究

王昊，赵亮 ，王东升

作者单位：中国科学技术大学附属第一医院,a检验科,b呼吸科，安徽 合肥 230001

肺癌是全球发病率和病死率较高的一种恶性肿瘤，晚期肺癌的5年生存率较差，主要原因是化疗耐药性的产生。化疗是治疗肺癌的重要方法，顺铂(cisplatin)是肺癌化疗的首选药物，顺铂与肿瘤细胞中DNA交叉连接，形成复合物，阻断肿瘤细胞DNA的复制，最终引起肿瘤细胞凋亡[1]。肺癌病人经过初期顺铂化疗后，肿瘤进程得到控制，但经过一段时间的持续给药治疗后，就会对顺铂的敏感性降低，获得耐药性，最终达不到预期治疗效果。

肿瘤干细胞(cancer stem cell)是一类存在于肿瘤组织中的细胞，它们具有自我更新的能力，并且可以分化成为不同家族的肿瘤细胞构成整个肿瘤[2]。肿瘤细胞具有肿瘤干细胞表型后可以获得更强的微球形成能力，分化成其他类型的肿瘤细胞，肿瘤干细胞表型的获得是恶性肿瘤重要的生物学特性，也是肿瘤复发的重要因素[3]。近年来，有文献报道称肿瘤干细胞表型可以促进肿瘤化疗耐药性的产生，同样地，耐药细胞株也获得了更强的肿瘤干细胞特性，表明肿瘤干细胞表型与肿瘤化疗耐药密切相关[3]，然而，其中的分子机制并不明确。本研究2015年9月至2016年9月检测了肺癌耐药株和亲本株细胞的肿瘤干细胞表型，并对其中的分子机制进行了探讨，以期为深入理解肿瘤化疗耐药和肿瘤干细胞表型的关系提供一些有益的实验依据和理论基础。

1 材料与方法

1.1 细胞培养肺癌细胞A549和耐药株A549/CIS由本实验室培养。培养于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，置5%CO2，37 ℃的培养箱中培养。

1.2 主要试剂顺铂和LY294002购自Sigma-Aldrich公司；western蛋白裂解液购自碧云天；荧光定量-PCR试剂和CCK8试剂购自合肥飒英思生物技术公司；抗体pAKT、AKT、p65、p-p65、pMAPK-p38和MAPK-p38购自Cell Signaling Technology公司；抗体GAPDH购自武汉三鹰生物公司。

1.3 微球形成实验A549和A549/CIS细胞以1 000/mL的密度接种于12孔低吸附细胞培养板，设置3个复孔，加入1 mL微球形成培养基(无血清的DMEM/F12培养基中添加1×B27试剂、终浓度为20 ng/mL的EGF、终浓度为20 ng/mL的bFGF、终浓度为5 g/mL的胰岛素、终浓度为1 g/mL的氢化可的松以及1%的双抗)，每隔3天补加一定量新鲜的微球形成培养基，培养9 d后，在显微镜下观察微球形成情况，对每个培养孔中的微球(>20 μm)进行计数并拍照。

1.4 Western blotting检测A549和A549/CIS细胞经相应的处理后，用预冷PBS轻轻洗涤3次，冰上用Western蛋白裂解液裂解15 min，12 000 r/mim离心20 min收集上清；用BCA方法对蛋白进行定量，每组用等量蛋白样品进行SDS-PAGE电泳分离，200 mA恒定电流电转90 min将蛋白转印至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭孵育2 h，抗体均以1∶1 000比例4 ℃孵育过夜，经PBST洗涤3次后，加入二抗以1∶5 000室温孵育1.5 h，PBST洗涤3次，用ECL化学发光试剂在Western自动曝光仪中曝光。

1.5 CCK8实验A549和A549/CIS细胞经相应的处理后，以每孔8×103/mL接种于96孔细胞培养板，第2天贴壁生长后用不同浓度顺铂处理细胞，设5个复孔，同时设立DMSO作为LY294002的对照组。加药处理细胞24 h后，去除培养基，每孔加入100 mL新鲜培养基，同时每孔加入10 mL CCK8试剂，继续培养4 h，用酶标仪在450 nm激发光波长处检测OD值，去除每组中的最大值和最小值，以平均值来计算细胞存活率=(对照组OD值-实验组OD值)/对照组OD值，实验重复3次。

2 结果

2.1 A549/CIS细胞获得更强的肿瘤干细胞特性利用微球形成实验比较A549和A549/CIS细胞的肿瘤干细胞特性，结果显示，在低吸附细胞培养板中生长9 d后，与A549细胞相比，A549/CIS细胞的分化生长能力更强，形成的微球数目明显增多(图1)。

图1 微球形成实验比较A549和A549/CIS细胞的肿瘤干细胞特性(×200)

2.2 A549/CIS细胞中AKT信号通路被激活我们进一步研究了耐药细胞获得肿瘤干细胞特性的分子机制，检测了亲本株和耐药株细胞中与肿瘤干细胞表型相关信号通路AKT、p65和MAPK-p38的活化情况。Western blotting结果显示(图2)：与A549细胞相比，A549/CIS细胞中磷酸化p65和MAPK-p38的程度没有明显改变，而磷酸化AKT的程度明显增加，提示了AKT信号通路的激活可能在耐药细胞获得肿瘤干细胞表型的过程中发挥了一定的调控作用。

图2 A549/CIS细胞中AKT信号通路被激活Western blotting实验比较A549和A549/CIS细胞中AKT、p65和MAPK-p38信号通路的磷酸化情况

2.3 LY294002逆转了A549/CIS细胞的肿瘤干细胞表型为了进一步研究AKT信号通路的激活在耐药细胞获得肿瘤干细胞表型过程中的作用，我们使用了AKT信号通路的抑制剂LY294002处理A549/CIS细胞，并检测对AKT、p65和MAPK-p38信号通路的影响，结果显示，LY294002抑制了AKT信号通路的磷酸化，而对p65和MAPK-p38信号通路的活化没有明显影响(图3A)。随后我们检测了LY294002对A549/CIS细胞获得肿瘤干细胞表型的影响，微球形成实验结果显示，LY294002处理减少了A549/CIS细胞的微球形成能力(图3B)。这些结果共同表明，AKT信号通路的活化在肺癌耐药细胞获得肿瘤干细胞表型过程中发挥了重要的调控作用。

图3 LY294002对A549/CIS细胞肿瘤干细胞特性的影响:A为Western blotting实验检测LY294002对A549/CIS细胞中AKT、p65和MAPK-p38信号通路的影响；B为微球形成实验检测LY294002对A549/CIS细胞肿瘤干细胞特性的影响(×200)

2.4 LY294002降低了A549/CIS细胞对顺铂的耐受性最后，我们研究了AKT信号通路的激活对于A549/CIS细胞获得顺铂耐药性的影响。用梯度浓度的顺铂联合LY294002处理A549/CIS细胞48h，结果显示，与对照组相比，LY294002可以降低A549/CIS细胞对顺铂的耐受性(图4)。

3 讨论

肺癌是全球范围内危害较大的肿瘤，化疗是目前治疗肺癌的主要方法之一，顺铂是目前治疗肺癌的重要化疗药物，而耐药性的产生最终导致了肺癌的治疗失败。近年来，肿瘤干细胞特性和化疗耐药之间的相关性被广泛研究。一些耐药的肿瘤细胞比不耐药的亲代细胞具有更强的肿瘤干细胞特性，比如，对顺铂耐药的非小细胞肺癌展示出了肿瘤干细胞特性[4]；对抗凋亡的胰腺癌细胞获得了肿瘤干细胞特性和微球形成能力，表达肿瘤干细胞相关基因[5]。而具有肿瘤干细胞特性的细胞会抵抗肿瘤化疗和放疗治疗[6-8]。这些研究表明化疗耐药性和肿瘤干细胞特性之间存在密切关系。本研究检测了人肺癌耐顺铂细胞A549/CIS和亲本细胞A549的肿瘤干细胞特性变化，发现与亲本细胞相比，耐药细胞的微球形成能力明显增强，表明其获得了更强的肿瘤干细胞特性。

图4 LY294002对A549/CIS细胞对顺铂耐受性的影响(F=9.135)

肿瘤干细胞特性的获得涉及复杂的机制，许多信号通路涉及肿瘤产生干细胞特性的过程中，为肿瘤细胞传递重要的信号信息，其中，PI3K/AKT、MAPK-p38以及NF-κB信号通路与肿瘤干细胞特性的获得密切相关[9-11]。本研究检测了A549细胞和A549/CIS细胞中AKT、p65以及MAPK-p38信号通路的激活情况，发现与亲本细胞相比，耐药细胞A549/CIS中AKT通路明显被激活，而p65和MAPK-p38信号通路没有明显改变。近年来，不断有研究证明PI3K/AKT 信号通路的异常激活贯穿了肿瘤发生发展的各个阶段并发挥重要调控作用。miR-106b-5p通过激活PI3K/AKT信号通路，促进靶蛋白PTEN蛋白的表达，诱导肝癌细胞产生肿瘤干细胞特性[9]；PI3K/AKT/c-MYC信号通路轴的激活调控了食管鳞状细胞癌获得肿瘤干细胞表型的过程[12]。此外，PI3K/AKT信号通路在调节细胞增殖、凋亡和分化等方面具有重要作用[13]。结合研究的发现，我们推测PI3K/AKT 信号通路在肺癌细胞对顺铂产生耐药性以及耐药细胞获得干细胞特性过程中发挥了重要作用。我们使用了PI3K/AKT 通路抑制剂LY294002，发现它抑制了A549/CIS细胞的微球形成能力，减少其肿瘤干细胞特性，同时降低了A549/CIS细胞对顺铂的耐受性，这些结果共同表明PI3K/AKT 信号通路的激活在肺癌耐药细胞获得肿瘤干细胞特性以及耐药性方面发挥了非常重要的调控作用。本研究的不足之处是未能更加深入的探讨PI3K/AKT 信号通路是如何影响耐药细胞获得干细胞特性的，干细胞特性相关转录因子如Nanog、Oct4、BMI-1等在维持干细胞特性上发挥了重要作用，下一步的研究方向重点将探讨PI3K/AKT 信号通路是否通过影响了这些转录因子的表达而调控了耐药细胞的干细胞特性。

总结来说，我们证明了人肺癌耐顺铂细胞株A549/CIS相对于亲本株获得更强的肿瘤干细胞特性，而AKT 信号通路的激活在其中发挥了重要的调节作用，抑制AKT 信号通路，可以减少A549/CIS 细胞的干细胞特性并降低其对顺铂的耐受性，这些研究为肺癌的临床治疗提供可供参考的作用靶点和潜在的临床应用价值。