分散固相萃取-液相色谱-串联质谱法测定淡水鱼中柱孢藻毒素、节球藻毒素和微囊藻毒素

陈丽惠, 贾玉珠, 张 斌, 潘秋仁, 陈秦秦, 蔡伟鹏(厦门市疾病预防控制中心,福建 厦门 361021)

蓝藻毒素是蓝藻代谢过程中产生的有毒次生代谢产物,按照毒素作用的靶器官分类,主要有肝毒素、神经毒素、皮肤毒素和细胞毒素等[1]。其中,蓝藻肝毒素包括柱孢藻毒素(CYN)、节球藻毒素(NOD)和微囊藻毒素(MCs)3大类,常见的微囊藻毒素有MC-RR、MC-YR及MC-LR。蓝藻肝毒素不仅直接污染水体[2,3],还能在淡水生物体内产生蓄积[4,5],再通过食物链进入人体,导致肝脏和肾脏损伤[6],危害公众健康。因此,建立快速、灵敏、简便、可靠的蓝藻肝毒素的检测方法对于保障人民饮食安全具有重要意义。

目前,国内外的柱孢藻毒素、节球藻毒素和微囊藻毒素的检测方法主要有液相色谱法(LC)[7,8]、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)[9-12]和鸟枪串联质谱法[13]。已见报道的研究主要针对单类蓝藻毒素,未见同时检测CYN、NOD和MCs的文献报道。鱼肉中的CYN、NOD和MCs的前处理方法主要采用固相萃取法[14-16],但其过程繁琐,消耗溶剂大,分析成本偏高。

分散固相萃取法(DSPE)是2003年美国农业部提出的一种操作简单、快速、成本低廉的样品前处理技术[17],其原理是通过将吸附剂加入到样品提取液中,吸附干扰杂质,以达到净化样品的目的。对比传统的固相萃取技术,该技术更为简便,有效提高了前处理效率,并避免固相萃取中柱子易堵塞的问题，近年来在食品、环境等领域得到了广泛应用[18-20]。目前,以分散固相萃取法对CYN、NOD和MCs同时进行提取剂净化的方法未见报道。

本研究采用分散固相萃取法对鱼肉进行样品前处理,着重考察了提取溶剂及吸附剂的种类对提取效率及净化效果的影响,结合液相色谱-串联质谱技术,对淡水鱼中CYN、NOD及MCs(MC-RR、MC-YR和MC-LR)进行同时检测。该方法可为淡水鱼中多种蓝藻肝毒素的快速测定提供可靠的技术支持。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

6460液相色谱-三重四极杆质谱仪、1260高效液相色谱仪(美国Agilent公司);冷冻高速离心机(德国Sigma公司);KQ-500E型超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司)。

CYN、NOD及MCs(MC-RR、MC-YR、MC-LR)标准品由北京曼哈格生物科技有限公司提供;乙腈和甲醇(色谱纯,德国Sigma公司);N-丙基乙二胺粉末(PSA,天津博纳艾杰尔科技有限公司);C18粉末和酸性氧化铝粉末(A-AL)(美国Agilent公司);氯化钠(国药集团化学试剂有限公司)。

取适量上述标准溶液,用甲醇配制5种目标化合物的混合标准溶液,其中MC-RR、MC-YR、MC-LR及NOD的质量浓度为0.4 mg/L,CYN为1.0 mg/L,置于-18 ℃下避光保存。吸取适量上述混合标准溶液,用空白基质提取液稀释定容,配制成不同浓度的基质匹配标准溶液。

1.2 样品前处理

称取2.0 g(精确至0.01 g)粉碎均匀的市售鲢鱼鱼肉样品,置于30 mL离心管中,加入10 mL乙腈-水-甲酸溶液(89∶10∶1,v/v/v),涡旋振荡提取3 min,以10 000 r/min低温离心10 min,取2.0 mL上层清液,置于15 mL玻璃离心管中,加入100 mg C18吸附剂,涡旋混匀1 min,静置分层,取1.0 mL上清液,加入2.0 mL水,混匀后,过0.22 μm有机滤膜,待上机分析测定。

1.3 色谱条件

Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18色谱柱(50 mm×4.6 mm,1.8 μm);柱温为35 ℃;流动相A为水,B为乙腈;流速为0.3 mL/min。梯度洗脱程序为0～1.0 min,10%B～70%B;1.0～5.0 min,70%B～90%B;5.0～9.0 min,90%B;9.0～9.1 min,90%B～10%B;9.1～15.0 min,10%B。进样体积:10 μL。

1.4 质谱条件

离子源:ESI源,负离子模式;气流温度:350 ℃;气流速度:8 L/min;雾化气压力:0.2 MPa;鞘气(N2)温度:350 ℃;鞘气(N2)流速:11 L/min;毛细管电压:4 500 V;喷雾电压:0 V,电子倍增电压:580 V。其他质谱参数见表1。

表1 柱孢藻毒素、节球藻毒素、微囊藻毒素-RR、微囊藻毒素-YR和微囊藻毒素-LR的质谱参数Table 1 MS parameters of cylindrospermopsin (CYN),nodularin (NOD),microcystin-RR (MC-RR),microcystin-YR (MC-YR)and microcystin-LR (MC-LR)

* Quantitative ion.

2 结果与讨论

2.1 质谱和色谱条件的优化

MCs和NOD在结构上为环状多肽,CYN是一种环类生物碱,均为两性化合物,在ESI(+)和ESI(-)两种扫描模式下进行质谱分析时,均能找到相应的母离子,因此有必要对其响应强度进行比较,以选择合适的离子源模式。本实验考察了1.0 mg/L的5种蓝藻肝毒素的标准溶液在ESI(+)和ESI(-)模式下待测物的离子响应。以乙腈-0.1%(v/v)甲酸水溶液为流动相,考察5种待测物在ESI(+)模式下的响应,NOD和MC-RR的响应较好,CYN、MC-YR和MC-LR的响应较差。同时考察了在ESI(-)扫描模式下以乙腈-水溶液为流动相时待测物的响应,CYN、NOD、MC-YR和MC-LR的离子化效率较在ESI(+)模式下高,但MC-RR的质谱响应较差。综上,选择的离子化模式为ESI(-),与文献[21-23]报道相符。

在ESI(-)模式下,以乙腈-水为流动相,对待测物进行全扫描以确定各自的母离子,在二级质谱扫描中选择丰度最高的子离子作为定量离子,丰度次之的为定性离子,并对碰撞能量进行优化,具体质谱参数见表1。

分别选用Waters BEH C18(50 mm×2.1 mm,1.7 μm)、Phenomenex Luna C18(150 mm×2.0 mm,3 μm)和Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18(50 mm×4.6 mm,1.8 μm)色谱柱进行分析,以对色谱条件进行优化。采用Phenomenex Luna C18色谱柱时,MC-RR、MC-YR和MC-LR存在拖尾现象;采用Waters BEH C18色谱柱时,目标化合物的峰形较差;采用Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18色谱柱时,MC-RR、MC-YR和MC-LR的色谱峰形及分离度最佳,且与CYN和NOD实现完全分离。因此,选取Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18色谱柱对5种蓝藻肝毒素进行分离。

考察了采用乙腈-水,乙腈-5 mmol/L乙酸铵、乙腈-0.1%(v/v)甲酸水溶液作为流动相时的分离效果及离子化效率。结果表明,使用乙腈-水为流动相时,5种目标化合物的质谱响应较高,色谱峰形对称尖锐。因此本研究选择乙腈-水作为流动相。图1为基质加标样品中5种目标化合物的提取离子色谱图,目标物出峰段杂质干扰较小。

图1 基质加标样品中5种化合物(5 μg/L)的提取离子色谱图Fig.1 Extracted ion chromatograms of the five compounds (5 μg/L)in matrix spiked samples

图2 不同提取溶剂对5种化合物回收率的影响(n=3)Fig.2 Effect of different extraction solvents on the recoveries of the five compounds (n=3) A:methanol-formic acid (99∶1,v/v);B:acetonitrile-water (90∶10,v/v);C:methanol;D:acetonitrile-water-formic acid (89∶10∶1,v/v/v).

2.2 分散固相萃取前处理条件优化

2.2.1提取溶剂的选择

甲醇、甲醇水溶液和乙腈水溶液是提取生物体中蓝藻毒素常用的提取溶剂[24-26],在提取溶液中加入适量甲酸可提高蓝藻毒素的提取效率[27]。因此,本研究考察了采用甲醇、甲醇-甲酸(99∶1,v/v)、乙腈-水(90∶10,v/v)和乙腈-水-甲酸(89∶10∶1,v/v/v)时的提取效率(见图2)。结果表明，以乙腈-水-甲酸(89∶10∶1,v/v/v)为提取液时,5种目标化合物的回收率为66.0%～97.4%,明显高于采用乙腈-水(90∶10,v/v)为提取液时的14.1%～47.9%和采用甲醇-甲酸(99∶1,v/v)时的61.4%～112.4%,也高于甲醇的22.7%～43.7%。实验结果表明,在提取液中加入1%(v/v)甲酸可明显提高待测物的提取效率,并有效降低基质效应。综合考虑,实验选择以乙腈-水-甲酸(89∶10∶1,v/v/v)为提取溶剂。

2.2.2进样溶剂的优化

本方法以乙腈-水-甲酸(89∶10∶1,v/v/v)作为提取液,发现提取液提取样品后直接进样,基质效应较大,且由于进样溶液与流动相初始比例相差较大,大部分化合物的峰形较差。因此,为减少基质效应,同时优化峰形,可在提取液中加入水进行稀释[26]。本实验采用在1.0 mL净化液中加入2.0 mL水进行稀释,使进样溶剂与初始流动相乙腈-水体系更接近,以优化峰形。

2.2.3分散固相萃取吸附剂的选择

分散固相萃取的吸附剂应吸附提取液中的主要杂质但不吸附待测物,以达到净化提取液的目的。C18、PSA和A-AL是常见的分散固相萃取吸附剂,用于吸附鱼肉及其他食品中的多种干扰杂质,起到净化样品提取液的作用[28-31]。其中,C18为非极性吸附剂,主要去除脂类和弱极性杂质;PSA为弱阴离子交换剂,主要去除有机酸、金属离子和酚类等[32];A-AL也有一定的脱脂效果,能够降低基质干扰[33]。本实验比较了C18、PSA和A-AL 3种分散固相萃取吸附剂对鱼肉样品提取液中待测物的净化回收效果(见图3)。以A-AL和PSA为吸附剂时,5种待测物的回收率均低于60%,达不到检测要求。以C18为吸附剂对鱼肉样品提取液进行净化时,净化效果及回收率明显优于其他2种吸附剂。因此,本研究选用C18作为分散固相萃取的吸附剂。

图3 不同吸附剂对5种化合物回收率的影响(n=3)Fig.3 Effect of different sorbents on the recoveries of the five compounds (n=3)PSA:primary secondary amine;A-AL:acidic alumina.

2.3 基质效应的评估

用乙腈-水-甲酸(89∶10∶1,v/v/v)作为稀释液配制溶剂标准曲线,同时取不含待测物的鱼肉样品,按照前处理步骤进行提取、净化,得到空白样品基质溶液,以空白样品基质溶液为稀释液配制基质校准曲线。根据公式,基质效应=基质匹配校准曲线的斜率/溶剂标准校准曲线的斜率[34],斜率在0.8～1.2之间可认为无基质效应,斜率越接近1,表明基质效应越弱。实验结果表明,5种待测物的斜率比均低于0.8,表明样品经过分散固相萃取后虽然取得了良好的净化效果,但仍无法完全消除基质效应,而基质效应的存在会影响检测结果的准确性,为消除基质效应干扰,实验采用相应基质匹配标准溶液进行校准。

2.4 方法评价

2.4.1线性范围、检出限和定量限

用空白基质提取液作为稀释液,配制5种目标化合物的基质标准溶液,经过LC-MS/MS测定后,以目标化合物定量离子的峰面积(y)为纵坐标,质量浓度(x,μg/L)为横坐标作图,绘制基质校正标准曲线。结果表明,5种目标化合物在各自范围内线性关系良好,相关系数(R2)为0.995 4～0.999 4。以3倍和10倍信噪比计算得5种目标化合物的检出限(LOD)和定量限(LOQ),结果表明,LOD为5～10 μg/kg,LOQ为15～40 μg/kg(见表2)。

表2 5种目标化合物的线性范围、线性方程、相关系数、检出限和定量限Table 2 Linear ranges,linear equations,correlation coefficients (R2),limits of detection (LODs)and limits of quantification (LOQs)

y:peak area of quantitative ion;x:mass concentration,μg/L.

2.4.2回收率和精密度

在阴性鲢鱼肉样品中进行加标回收试验和精密度验证。在粉碎后的阴性鲢鱼肉样品中,NOD、MC-RR、MC-YR、MC-LR的低、中、高添加水平为30、60和150 μg/kg,CYN的低、中、高添加水平为75、150和375 μg/kg,按照1.2节进行样品前处理,再进行LC-MS/MS测定,5种目标化合物的回收率为62.3%～101.2%,RSD(n=6)为0.3%～8.6%(见表3)。

表3 5种目标化合物的平均回收率与精密度(n=6)Table 3 Average recoveries and precisions of the five target compounds (n=6)

Low,medium and high levels:30,60 and 150 μg/kg for NOD,MC-RR,MC-YR and MC-LR;75,150 and 375 μg/kg for CYN.

2.5 实际样品分析

采用本方法对市售11份鲫鱼、10份草鱼、6份鲢鱼及3份野生鲫鱼的鱼肉样品中CYN、NOD及MCs(MC-RR、MC-YR、MC-LR)的含量进行检测。结果表明,所有样品的鱼肉均未检出CYN、NOD及MCs。

3 结论

本研究建立了分散固相萃取-液相色谱-串联质谱同时测定淡水鱼中柱孢藻毒素、节球藻毒素和微囊藻毒素的方法。与现有方法相比,该法样品前处理更为简便、高效、经济,适用于淡水鱼中多种蓝藻肝毒素的快速筛查和准确定量。