高效液相色谱法同时测定氧化型染发产品中33种染发剂

左 雪, 邸 铮, 张 蓉, 邬国庆(北京市药品检验所,北京 102206)

随着人们生活水平的日益提高,染发作为一种美容方式,逐步成为流行时尚。合成染发剂主要分为暂时型、半永久型及永久型等3类[1],现今市场销售的染发产品80%为永久型(又称“氧化型”)[1,2]。氧化型染发产品中的染料中间体主要为芳香胺类、酚类化合物,这类成分具有一定的致敏性与致癌性[1-4]。因此,建立一种快速、准确的测定方法,为氧化型染发产品研发和监管提供有效的技术手段,显得十分重要。

目前,染发剂的检测方法主要有离子色谱法[5]、液相色谱法[6-10]、气相色谱法[11]、液相色谱-质谱法[12-14]、气相色谱-质谱法[15,16]及超临界流体色谱法[17]等。采用气相色谱法进行检测时,由于多数染发剂不具有良好的挥发性,而需通过衍生化处理,实验过程较繁琐,可测定成分种类也受到限制;液相色谱-质谱法虽具有良好的灵敏度与准确性,但分析复杂样品时,易造成离子源污染,且仪器成本较高,不易普及;染发剂的强极性、不稳定性及低挥发性等特征,使液相色谱法成为一种较为理想且易推广的检验方法。《化妆品安全技术规范》(后简称“规范”)(2015年版)[18]中限定了74种准用染发剂,并规定了对苯二胺等32种组分的检测方法,可实现多组分的分离与定量。严巍[19]等也根据pKa值差异实现了32种染发剂的分组测定。两种方法涵盖组分虽多,但均需同时建立3个色谱系统,实验过程耗时较长,对仪器、色谱柱及试剂的消耗较大。还有多篇文献[6-10,20-22]通过建立单一色谱系统实现多种染发剂的含量测定,方法快速、简便,但分析对象最多只涉及20种左右的禁限用组分,难以满足对氧化型染发产品的监管需求。

综合考察氧化型染发产品配方,选定33种禁限用染发剂,建立了单一液相色谱系统,同时实现多成分定量分析,为氧化型染发产品中染发剂的准确、高效检测以及质量监管提供技术支持。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

1260型高效液相色谱仪配二极管阵列检测器,美国Agilent公司;KQ-500型超声波清洗器,昆山市超声仪器有限公司;CP225D型电子分析天平,德国Sartorius公司。

对苯二胺(p-phenylenediamine)、2,6-二氨基吡啶(2,6-diaminopyridine)、对氨基苯酚(p-aminophenol)、甲苯-2,5-二胺硫酸盐(toluene-2,5-diamine sulfate)、间苯二胺(m-phenylenediamine)、氢醌(hydroquinone)、间氨基苯酚(m-aminophenol)、4-氨基间甲酚(4-amino-m-cresol)、邻苯二胺(o-phenylenediamine)、间苯二酚(resorcinol)、2-硝基对苯二胺(2-nitro-p-phenylenediamine)、N,N-二乙基甲苯-2,5-二胺盐酸盐(N,N-diethyltoluene-2,5-diamine HCl)、甲苯-3,4-二胺(toluene-3,4-diamine)、1-萘酚(1-naphthol)均购自德国Dr.Ehrenstorfer公司;2,4-二氨基苯氧基乙醇盐酸盐(2,4-diaminophenoxyethanol HCl)、N,N-二乙基对苯二胺硫酸盐(N,N-diethyl-p-phenylenediamine sulfate)、对甲基氨基苯酚硫酸盐(p-methylaminophenol sulfate)、6-羟基吲哚(6-hydroxyindole)、1,5-萘二酚(1,5-naphthalenediol)均购自北京曼哈格生物技术有限公司;四氨基嘧啶硫酸盐(tetraaminopyrimidine sulfate)、2-氯对苯二胺硫酸盐(2-chloro-p-phenylenediamine sulfate)均购自北京百灵威科技有限公司;2-甲基间苯二酚(2-methylresorcinol)、4-氨基-3-硝基苯酚(4-amino-3-nitrophenol)、4-氯间苯二酚(4-chlororesorcinol)、N-苯基对苯二胺(N-phenyl-p-phenylenediamine)均购自美国Sigma公司;4-氨基-2-羟基甲苯(4-amino-2-hydroxytoluene)、4-硝基邻苯二胺(4-nitro-o-phenylenediamine)、6-氨基间甲酚(6-amino-m-cresol)均购自日本东京化成工业株式会社;2-氨基-3-羟基吡啶(2-amino-3-hydroxypyridine)、2,7-萘二酚(2,7-naphthalenediol)均购自加拿大TRC公司;4,5-二氨基-1-(2-羟乙基)吡唑硫酸盐(1-hydroxyethyl 4,5-diaminopyrazole sulfate)、羟乙基对苯二胺硫酸盐(hydroxyethyl-p-phenylenediamine sulfate)、N,N-双(2-羟乙基)-对苯二胺硫酸盐(N,N-bis(2-hydroxyethyl)-p-phenylenediamine sulfate)均购自美国Ark Pharm公司。所有对照品纯度均大于95%。

乙腈(色谱纯)购自德国Merck公司;Milli-Q超纯水系统购自法国Millipore公司;磷酸二氢钾、十二水合磷酸氢二钠均为分析纯,购自国药集团化学试剂有限公司;亚硫酸氢钠(分析纯)购自北京化学试剂公司;无水乙醇(优级纯)购自现代东方(北京)科技发展有限公司。

样品均为市售氧化型染发产品,包含染发膏和氧化乳两种剂型。

1.2 溶液配制

流动相A相溶液:称取5.6 g磷酸二氢钾、3.6 g十二水合磷酸氢二钠,加水溶解,稀释并定容至1 000 mL,充分混匀后,经0.22 μm微孔滤膜过滤,得磷酸盐缓冲液(0.04 mol/L磷酸二氢钾+0.01 mol/L磷酸氢二钠)。取960 mL上述缓冲液与40 mL乙腈充分混匀,备用。

稀释溶剂:称取0.2 g亚硫酸氢钠,加入流动相A相溶液溶解,稀释并定容至1 000 mL,充分混匀,备用。

标准储备溶液:称取染发剂对照品各50.0 mg,置于50 mL棕色量瓶中,加入10 mL无水乙醇以及适量稀释溶剂,超声至充分溶解,再加入稀释溶剂至刻度,摇匀,即得混合标准储备溶液。4 ℃保存。

1.3 样品前处理

取样品中染发膏0.5 g(精确到0.001 g),置于50 mL比色管中,分别加入5 mL无水乙醇以及5 mL稀释溶剂,涡旋30 s,超声15 min,放冷后加入稀释溶剂至25 mL,涡旋30 s,充分混匀。经0.45 μm微孔滤膜过滤,待测。

1.4 色谱条件

色谱柱为Waters Atlantis®T3 MV Kit(250 mm×4.6 mm,5 μm),柱温为25 ℃,进样量为5 μL。流动相:A相为磷酸盐缓冲液(0.04 mol/L磷酸二氢钾+0.01 mol/L磷酸氢二钠,含4%(体积分数)乙腈),B相为乙腈。流速为1.0 mL/min。梯度洗脱程序见表1。氢醌、对甲基氨基苯酚硫酸盐、间苯二酚、4-氯间苯二酚、6-羟基吲哚、1,5-萘二酚、2,7-萘二酚、N-苯基对苯二胺、1-萘酚等9种成分检测波长为280 nm,其余成分检测波长均为235 nm。

表1 HPLC梯度洗脱程序Table 1 HPLC gradient elution procedure

Mobile phase A:0.04 mol/L potassium dihydrogen phosphate+0.01 mol/L disodium hydrogen phosphate-acetonitrile (96∶4,v/v);mobile phase B:acetonitrile.

2 结果与讨论

2.1 检测波长的选择

采用二极管阵列检测器进行全波长扫描(210～400 nm),发现各成分的最大吸收波长均集中于225～245 nm及275～310 nm范围,且低波长段响应值更强。综合考虑各成分吸收特点后,将235 nm作为首选检测波长。但氢醌、间苯二酚及N-苯基对苯二胺在280 nm下吸收强于235 nm,1,5-萘二酚、2,7-萘二酚及1-萘酚高浓度点在235 nm下响应超载,影响回归方程的线性,对甲基氨基苯酚硫酸盐、4-氯间苯二酚及6-羟基吲哚在235 nm下易受到基质与其他杂质峰的干扰,因此单独在280 nm下检测上述9个成分。33种染发剂在不同波长下的色谱图见图1。

图1 33种染发剂混合标准溶液在两种波长下的HPLC色谱图Fig.1 HPLC Chromatograms of the mixed standard solution of 33 hair dyes at two wavelengths Peak Nos:1.1-hydroxyethyl 4,5-diaminopyrazole sulfate;2.tetraaminopyrimidine sulfate;3.2-amino-3-hydroxypyridine;4.p-phenylenediamine;5.hydroxyethyl-p-phenylenediamine sulfate;6.2,6-diaminopyridine;7.p-aminophenol;8.toluene-2,5-diamine sulfate;9.m-phenylenediamine;10.hydroquinone;11.2,4-diaminophenoxyethanol HCl;12.m-aminophenol;13.4-amino-m-cresol;14.N,N-bis(2-hydroxyethyl)-p-phenylenediamine sulfate;15.o-phenylenediamine;16.p-methylaminophenol sulfate;17.resorcinol;18.2-chloro-p-phenylenediamine sulfate;19.N,N-diethyl-p-phenylenediamine sulfate;20.2-methylresorcinol;21.2-nitro-p-phenylenediamine;22.N,N-diethyltoluene-2,5-diamine HCl;23.4-amino-2-hydroxytoluene;24.toluene-3,4-diamine;25.4-nitro-o-phenylenediamine;26.4-amino-3-nitrophenol;27.6-amino-m-cresol;28.4-chlororesorcinol;29.6-hydroxyindole;30.1,5-naphthalenediol;31.2,7-naphthalenediol;32.N-phenyl-p-phenylenediamine;33.1-naphthol.

2.2 色谱柱的选择

对比了4种色谱柱的分离效果:采用HALO RP-Amide(250 mm×4.6 mm,5 μm)柱进行分析时,部分色谱峰峰形差,前延或拖尾现象严重;采用SUPELCO Discovery®RP Amide C16(250 mm×4.6 mm,5 μm)以及Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)柱时,大部分成分得到良好分离,且峰形较好,但仍有少数峰出现拖尾,另外,C16柱平衡时间较其他色谱柱更长,且货源较少;采用Waters Atlantis®T3 MV Kit(250 mm×4.6 mm,5 μm)柱时,各成分色谱峰峰形良好,整体分离效果优于前述3种色谱柱。因此,最终选择Waters Atlantis®T3 MV Kit柱对33种染发剂进行分离。

2.3 流动相的选择

图2 采用不同流动相时染发剂混合标准溶液HPLC色谱图Fig.2 HPLC Chromatograms of the mixed standard solution of hair dyes with different mobile phases a.0.02 mol/L potassium dihydrogen phosphate+0.005 mol/L disodium hydrogen phosphate-acetonitrile;b.0.02 mol/L potassium dihydrogen phosphate+0.01 mol/L disodium hydrogen phosphate-acetonitrile;c.0.02 mol/L potassium dihydrogen phosphate+0.02 mol/L disodium hydrogen phosphate-acetonitrile.

2.4 提取溶剂的优化

参考规范(2015年版)[18],选择2 g/L亚硫酸氢钠水溶液-无水乙醇(1∶1,v/v)作为提取与稀释溶剂。在对33种染发剂对照品进行液相分析时,发现2-氨基-3-羟基吡啶、对苯二胺及羟乙基对苯二胺等3种成分的色谱峰出现“溶剂效应”。因此,利用前述溶剂溶解或提取后,加入1.5倍体积流动相A相溶液做进一步稀释,所得溶液中各成分色谱峰峰形良好,可解决“溶剂效应”。但对此法制得对照品溶液进行稳定性试验时,发现四氨基嘧啶硫酸盐和2,4-二氨基苯氧基乙醇盐酸盐在12 h内的稳定性差,峰面积相对标准偏差超过20%,这可能是由于流动相中缺少抗氧化剂,两种成分氧化分解严重。因此,进一步在A相溶液中添加适量亚硫酸氢钠,可解决氧化分解问题。最终确定1.2节稀释溶剂,并按1.3节方法处理样品。

2.5 标准曲线、检出限及定量限

用稀释溶剂配制质量浓度为5.0、10.0、50.0、100.0、250.0和500.0 mg/L的标准曲线系列溶液,分别进样5 μL,在1.4节色谱条件下进行分析。以对照品溶液质量浓度(mg/L)为横坐标、峰面积为纵坐标进行线性回归。取0.5 g(精确到0.001 g)基质空白样品(染发膏配方中不含本文的33种成分),加入不同浓度的混合标准溶液,按1.3节方法制备待测溶液,以信噪比(S/N)为3时对应的对照品浓度作为检出限(LOD),S/N为10时对应的对照品浓度作为定量限(LOQ)。结果如表2所示,4-氨基-2-羟基甲苯、4-硝基邻苯二胺在5～250 mg/L,其他成分在5～500 mg/L范围内线性关系良好,相关系数均高于0.999。

2.6 精密度

吸取5 μL 100 mg/L标准曲线系列溶液,按1.4节色谱条件连续进样6次,计算峰面积相对标准偏差(RSDs)。结果表明,所有成分峰面积RSDs值均低于2.0%,方法精密度良好。

表2 33种染发剂的回归方程、线性范围、相关系数、检出限及定量限Table 2 Regression equations,linear ranges,correlation coefficients,limits of detection (LODs),and limits of quantification (LOQs)of 33 hair dyes

Nos.are the same as the peak Nos.in Fig.1.A:peak area;C:mass concentration,mg/L.

2.7 稳定性

取100 mg/L标准曲线系列溶液,室温条件下分别于第0、4、8、12、16、20、24 h进行测定,进样5 μL,在1.4节色谱条件下进行分析,计算各成分峰面积RSDs值。结果表明,四氨基嘧啶硫酸盐和2,4-二氨基苯氧基乙醇盐酸盐在12 h内峰面积RSDs小于5%,其余31种成分在24 h内峰面积RSDs均小于5%,各成分稳定性良好。但对于含有四氨基嘧啶硫酸盐或2,4-二氨基苯氧基乙醇盐酸盐的染发类产品,建议临用现制,或选择带有可控温样品室的液相色谱仪进行分析。

表3 33种染发剂在3个不同浓度水平下的平均加标回收率及其相对标准偏差(n=3)Table 3 Average spiked recoveries and relative standard deviations (RSDs)of 33 hair dyes at three different concentration levels (n=3)

Nos.are the same as the peak Nos.in Fig.1.

2.8 加标回收率

取9份基质空白样品,每份0.5 g(精确至0.001 g),分别加入混合标准储备溶液1.0、2.5、5.0 mL,各3份(相当于待测液中各成分含量为40、100、200 mg/L),按1.3节方法平行制备待测溶液,进样5 μL,在1.4节色谱条件下进行分析。平均回收率及RSDs结果见表3。结果表明,33种成分在40 mg/L水平下的平均回收率为79.2%～116.3%,在100 mg/L水平下的平均回收率为83.1%～110.5%,在200 mg/L水平下的平均回收率为77.6%～113.5%,各浓度下的RSDs值均小于5%。

图3 6种染发剂的紫外吸收谱图Fig.3 Ultraviolet absorption spectra of six hair dyes a.1-hydroxyethyl 4,5-diaminopyrazole sulfate (No.1 in Fig.1);b.tetraaminopyrimidine sulfate (No.2 in Fig.1);c.2-amino-3-hydroxypyridine (No.3 in Fig.1);d.p-phenylenediamine (No.4 in Fig.1);e.4-nitro-o-phenylenediamine (No.25 in Fig.1);f.4-amino-3-nitrophenol (No.26 in Fig.1).

2.9 方法适用性

如图1所示,按1.4节色谱条件进行分析时,以下3组成分分别具有相近的保留时间,难以分离:组分1(1-羟乙基-4,5-二氨基吡唑硫酸盐)和组分2(四氨基嘧啶硫酸盐);组分3(2-氨基-3-羟基吡啶)和组分4(对苯二胺);组分25(4-硝基邻苯二胺)和组分26(4-氨基-3-硝基苯酚)。针对上述情况,当样品在各组保留时间出峰时,需通过图3所示的各成分紫外吸收特征对色谱峰进行定性,若仅含组内1种成分,则可利用本文方法准确定量;若同时含有组内2种成分,则需建立其他方法进一步分离与定量。

利用国家药品监督管理局数据查询网站,对由20余个国内外厂家生产的90种市售氧化型染发产品配方进行统计,未见1-羟乙基-4,5-二氨基吡唑硫酸盐与四氨基嘧啶硫酸盐、4-硝基邻苯二胺与4-氨基-3-硝基苯酚同时在产品中使用的情况,2-氨基-3-羟基吡啶与对苯二胺仅在1批产品中同时使用。因此认为本方法适用于大多数染发类产品的检测。

表4 7批氧化型染发产品测定结果Table 4 Analytical results of seven batches of oxidative hair dye products

w=content in color cream×mass of color cream/(mass of color cream+mass of developer).

2.10 样品测定

表4为选取7批配方不同、含染发剂组分较多的典型氧化型染发产品进行含量测定的结果,测定结果经染发膏与氧化乳使用比例折算,表中数据代表实际使用含量。7批样品共检出19种限用染发剂,实测组分种类均与产品配方一致。其中,5批样品检出2.9节中涉及成分(1-羟乙基-4,5-二氨基吡唑硫酸盐、四氨基嘧啶硫酸盐、2-氨基-3-羟基吡啶、对苯二胺),经紫外吸收特征判定,未见2种组分同时出峰的情况,因而均可准确定量。

3 结论

利用高效液相色谱同时测定氧化型染发产品中33种染发剂的含量,操作简便、分析快速,具有较高灵敏度与准确性,基本覆盖了目前氧化型染发产品中的常用染发剂成分。从多种产品染发剂配方组成和样品实际测定结果看,本方法适用于大多数氧化型染发产品的检测。