青菜泡菜工业发酵过程中微生物群落结构变化分析

于文平，张亚豪，吴正云，宫尾茂雄，张文学,2*

(1.四川大学 轻纺与食品学院，成都 610065；2.四川大学锦江学院 白酒学院， 四川 眉山 620860；3.东京家政大学 家政学部，日本 东京 173-8602)

泡菜是一种以新鲜蔬菜为原料，在一定浓度食盐水中泡渍，厌氧或兼性厌氧条件下自然发酵而成的蔬菜制品[1]。中国泡菜历史悠久，文化深厚，最早可追溯到3000年前的周朝[2]。四川泡菜口感脆嫩，营养丰富，富含多种维生素、有机酸和活性乳酸菌，在中国西南地区被广泛食用[3]。目前，对于泡菜的研究大多停留在对泡菜原料、发酵工艺的优化及风味物质的分析，对泡菜中微生物群落结构的研究较少，如侯方丽等[4]以甘蓝为原料，通过自然发酵方式，探究出甘蓝泡菜发酵的最佳工艺，曹东等[5]采用SPME-GC-MS 对自制泡菜在发酵过程中不同时期的挥发性风味进行分析。

近年来，分子生物学免培养技术被广泛地应用到传统酿造食品的微生物群落研究中，其中，变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)是一种根据DNA片段溶解性质而使之分离的技术，最先由Muyzer等[6]提出，主要用于检测样品中免培养微生物的组成；实时荧光定量PCR(qPCR)作为一种对微生物进行定量的手段而被广泛用于各种食品的微生物定量分析。为探究四川工业泡菜发酵过程中微生物群落结构，本研究利用PCR-DGGE和qPCR技术对四川工业青菜泡菜中主要微生物进行定性和定量分析，旨在为四川泡菜的工业化发展提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

材料：取发酵1，3,5,13,26,41,68,81,103,110 d的青菜泡菜液(四川李记酱菜调味品有限公司)，置于-20 ℃下贮藏，以备后续实验。

试剂：E.Z.N.A.®水样DNA提取试剂盒(美国Omega公司)、DNA Marker(片段约200～2000 bp)；琼脂糖；2×Tag PCR MasterMix(法国Biowest公司)；40%丙烯酰胺; 双丙烯酰胺; 5×TAE缓冲液；尿素；过硫酸铵；去离子甲酰胺、SYBR Green I；无水乙醇；异丙醇；亚铁氰化钾；乙酸锌；四硼酸钠；对氨基苯磺酸；亚硝酸钠；盐酸萘乙二胺；0.1 mol/L NaOH标准溶液。

1.2 仪器

pH计(PHS-3C)、盐度计(PAL-SALT)；手持式阿贝折光仪(WZ-201)；梯度PCR仪(MyCyclerTMThermal Cycler)；高速冷冻离心机(Sorvall Legend Micro 17R)；DGGE(D-CodeTMUniversal Mutation Detection System)；荧光定量PCR仪(LightCycle®Nano)；电泳仪(DYY-5)；凝胶成像仪(Gel DocTMXR+)；核酸微量分光光度计(NanoDrop 2000)；单人单面净化工作台(SW-CJ-1FD)；迷你离心机(LX-400)；数显恒温水浴锅(HH)；微型旋涡混合仪(WH-2)。

1.3 实验方法

1.3.1 泡菜理化指标测定

pH、盐度(salinity)、可溶性固形物(TSS)，分别使用pH计、盐度计和手持式阿贝折光仪参照仪器使用方法测定。

泡菜液中总酸(以乳酸计，TTA)含量采用GB/T 12456-2008《食品中总酸的测定》[7]方法测定。

泡菜液中亚硝酸盐含量(nitrite concentration)采用GB 5009.33—2016《食品安全国家标准 食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》[8]方法测定。

1.3.2 泡菜DNA提取及PCR扩增

利用E.Z.N.A.®水样DNA提取试剂盒提取泡菜液样品中微生物的基因组DNA。使用P3f (5′-CC TAC GGG AGG CAG CAG-3′)和P2r (5′-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3′)进行16S rRNA扩增，使用NS3f (5′-GC AAG TCT GGT GCC AGC AGC C- 3′)和YM951r (5′-TTG GCA AAT GCT TTC GC- 3′)进行18S rRNA扩增[9]。扩增体系为50 μL，包括2×PCR Mix(5 mL)，前后引物各20 pmol，DNA模板10 ng，用双蒸水补足。扩增程序参照Liang等[10]的方法扩增产物使用2%的琼脂糖凝胶进行电泳得到目的条带。

1.3.3 PCR-DGGE分析

将1.3.2得到的扩增产物在8%聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，电泳液是1×TAE缓冲液。细菌和真菌凝胶电泳的变性剂梯度浓度范围分别是30%～55%和20%～40%。细菌PCR扩增产物在200 V恒压下电泳4 h，真菌PCR扩增产物在160 V恒压下电泳4.5 h。电泳结束后，用Gel DocTMXR (Bio-Rad Laboratories)进行成像，观察结果。

将图谱上的主要条带进行切割回收，将回收产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行克隆测序。将测序序列在NCBI中用BLAST进行序列对比，获得与GenBank数据库中相似的序列，然后在RDP中进行分类。

1.3.4 qPCR分析

实时荧光定量PCR用于检测青菜泡菜发酵过程中乳杆菌属的数量变化。扩增引物为Lac-f(5′-GCA GCA GTA GGG AAT CTT CCA-3′)和Lac-r(5′-GCA TTY CAC CGC TAC ACA TG-3′)[11]。扩增反应体积是20 μL(1 mL SYBR®Green PCR Master Mix, 2 pmol引物，DNA模板，用双蒸水补足)。扩增程序：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，共40个循环，每个循环末端收集荧光信号。反应结束后，以标准品浓度的对数作为横坐标，阈值循环数Cq作为纵坐标绘制标准曲线。

2 结果与分析

2.1 泡菜发酵过程中的理化特性

泡菜发酵过程中pH、TTA、TSS、盐度和亚硝酸盐含量的变化见图1。

观察泡菜pH的变化趋势，发现随着发酵的进行，泡菜液的pH从起始的5.90逐渐下降，最终稳定在3.88；泡菜的起始TTA含量为0.67 g/L，随着发酵进行逐渐上升，发酵81 d后达到最高6.86 g/L，之后再次下降，至终止取样时降至5.53 g/L。一般认为，泡菜的pH小于4.0，且TTA大于3.0 g/L，是泡菜成熟的标志。可见发酵81 d时，青菜泡菜已可认为发酵成熟。

从发酵开始至发酵结束，泡菜TSS和盐度有所波动，但变化不大；前者基本维持在8.80%～11.80%之间，后者基本维持在5.30%～6.60%之间，两者在发酵81 d后基本保持稳定。

图1 工业青菜泡菜发酵过程中理化特性变化Fig.1 The changes of physico-chemical properties of industrial pickled vegetables during fermentation

亚硝酸盐具有致癌性，对人体有害，国标GB 2762-2017《食品安全国家标准 食品中污染物限量》规定泡菜中的亚硝酸盐含量限量为20 mg/kg。由图1可知，泡菜中亚硝酸盐含量在发酵第1天为最高峰，亚硝酸盐主要来源于青菜原料；随着发酵进行，亚硝酸盐含量持续降低，发酵第3天已低于限量值的一半以下，13 d后保持稳定，维持在6.0 mg/kg左右。

2.2 泡菜发酵过程中细菌群落结构

青菜泡菜发酵过程中多样性指数(H，S和E)大小及其变化见表1。

表1 工业青菜泡菜发酵过程中细菌和真菌多样性 及乳杆菌属qPCR定量结果Table 1 Diversity of bacteria and fungi during industrial pickled vegetables fermentation and qPCR quantitative results of Lactobacillus

H，S和E值分别代表微生物的群落多样性、丰富度和均匀度。由表1可知，H值从第1天的2.32增至第5天的2.91，但随后又降至第110天的2.65；S值从第1天的16增加至第13天的24，最终稳定在24～26之间；E值在发酵过程中始终稳定在0.82～0.93之间。总的来说，泡菜发酵不同阶段微生物多样性、丰富度和均匀度均有变化，推测与泡菜液中pH的变化有关，不耐酸微生物在低pH环境下生长受到抑制。

细菌的DGGE图谱见图2中A，共出现30个条带，具体测序结果见表2。

图2 工业青菜泡菜的细菌(A)和真菌(B)PCR-DGGE条带Fig.2 The bacteria (A) and fungi (B) PCR-DGGE banls of industrial pickled vegetables

注：泳道1～110表示泡菜发酵的1～110 d，黑色箭头表示切下测序的条带，具体测序结果见表2。

表2 DGGE条带测序结果Table 2 The seguencing results of DGGE

续 表

由图2中A和表2可知，泡菜样品含有2个门，厚壁菌门(Firmicutes，19个条带)和变形菌门(Proteobacteria，11个条带)，共包含12个属，包括乳杆菌属(Lactobacillus，条带6，7，8，9，16，18，25，30)、盐单胞菌属(Halomonas，条带17，28，29)、假单胞菌属(Pseudomonas，条带4，10，14)，弧菌科细菌(Vibrionaceaebacterium，条带2)、环菌丝属(Brochothrixthermosphacta，条带11)、欧文氏菌属(Erwinia，条带15)、盐弧菌属(Salinivibrio，条带22)和其他未分类菌属。

由图3中A可知，乳杆菌属是青菜泡菜中主要的优势微生物，这与Liang等[12]之前的研究结果一致；而Xiong等的研究进一步发现中国自然发酵泡菜中主要存在的乳杆菌属是植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)和玉米乳杆菌(Lactobacilluszeae)。乳酸菌在泡菜发酵过程中能产生大量的有机酸，如乳酸、草酸、柠檬酸、醋酸等，导致发酵液的pH值降低，进一步抑制其他杂菌的生长。

图3 工业青菜泡菜发酵过程中细菌(A) 和真菌(B)属水平上群落组成Fig.3 Community composition of bacteria (A) and fungi (B) on genera level during industrial pickled vegetables fermentation

由表2可知，工业青菜泡菜中的乳杆菌属是消化乳杆菌(Lactobacillusalimentarius)和植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)。消化乳杆菌能够抑制腐败微生物的生长，延长发酵食品的保质期，提高产品的质量安全，是天然的生物防腐剂[13]。植物乳杆菌产生的乳酸，是泡菜酸味的主要来源，在发酵过程中可与醇、醛和酮类发生反应，产生大量的风味物质[14,15]。由图3中A可知，工业青菜泡菜中相对含量最高的是乳杆菌属、盐单胞菌属和假单胞菌属。盐单胞菌属能够耐盐，分解葡萄糖，产生多种风味物质，它的存在与工业生产泡菜“盐渍”这一步骤有关[16]。假单胞菌属存在于新鲜蔬菜中，生存能力强，适应环境范围广[17]。

2.3 泡菜发酵过程中真菌群落结构

真菌DGGE图谱见图2中B，共出现了12个条带，具体测序鉴定结果见表2。由表2可知，真菌群落的H值在1.41～1.98之间，S值在5～9之间，E值在0.72～0.92之间，由此可见真菌群落的多样性和丰富度均低于细菌群落。结合图2中B和表2可知，泡菜样品含有5个属的真菌，分别是德巴利氏酵母属(Debaryomyces，条带1,2,5,6,7,8)、假丝酵母属(Candida，条带3,11,12)、Cystofilobasidium(条带10)、酵母属(Saccharomyces，条带4)、柯达酵母属(Kodamaea，条带9)，其中德巴利氏酵母属是工业青菜泡菜中的优势真菌属。汉逊德巴利氏酵母属(Debaryomyceshansenii)是青菜泡菜风味物质形成的重要菌属，可以分解葡萄糖产生D-阿拉伯糖和乙酸乙酯，使泡菜风味更加协调[18]。假丝酵母和酵母属能够利用果糖产生酒精[19,20]。

2.4 泡菜发酵过程中微生物群落的RDA分析

图4 工业青菜泡菜微生物群落的RDA分析Fig.4 RDA analysis of microbial community structures of industrial pickled vegetables

注：箭头和长度表示5种变量与微生物群落结构的相关性大小；○表示发酵时间，△表示微生物名称。

由图4可知，亚硝酸盐含量(nitrite concentration)和盐度(salinity)与发酵第1天的相关性较大，pH与发酵3～26 d的相关性较大，TTA和TSS则与发酵41～110 d的相关性较大。pH值的变化与发酵过程中产生的有机酸有关，低pH能够抑制病原菌的生长，从而保证泡菜的安全。pH主要在发酵前期的作用较为明显，而TTA在发酵后期的作用较为明显，这与图4反映的信息一致。研究表明，乳杆菌属能够抑制发酵过程中亚硝酸盐还原酶的活性，降低泡菜中亚硝酸盐的含量[21]。因此，随着乳杆菌数量的增加，泡菜中亚硝酸盐含量降低，这也解释了亚硝峰出现在泡菜发酵前期的现象。

由图4可知，微生物群落结构与泡菜发酵进程存在一定相关性，假丝酵母属(Candida)、Cystofilobasidium、弧菌属(Vibrio)、盐厌氧菌属(Halanaerobium)主要与发酵前期相关，假单胞菌属(Pseudomonas)、Wohlfahrtiimonas、盐单胞菌属(Halomonas)、环丝菌属(Brochothrix)、海螺菌属(Marinospirillum)、梭菌属(Clostridiaceae)、欧文氏菌属(Erwinia)、德巴利氏酵母属(Debaryomyces)与发酵中期相关，乳杆菌属(Lactobacillus)、柯达酵母属(Kodamaea)、酵母属(Saccharomycescerevisiae)、盐弧菌属(Salinivibrio)、疣微菌科(Ruminococcaceae)与发酵后期相关。

2.5 乳杆菌属的荧光实时定量PCR结果

根据细菌DGGE条带结果发现乳杆菌属是工业青菜泡菜中的优势菌属。工业青菜泡菜发酵过程中乳杆菌属数量的变化见表1，所有样品中，乳杆菌属的拷贝数为107～1011copies/mL，这表明发酵前后，乳杆菌属数量迅速增加，然后下降，最后稳定在1011copies/mL，该结果与张亚豪等[22]的研究结果一致。

3 结论

本文结合PCR-DGGE和qPCR技术主要研究了工业青菜泡菜发酵过程中的微生物群落结构演替规律及乳杆菌属含量变化。细菌群落中，发现2个门(厚壁菌门和变形菌门)、12个属，主要包括乳杆菌属、盐单胞菌属、假单胞菌属、弧菌属、盐弧菌属、欧文氏菌属等，其中乳杆菌属是优势菌属，发酵过程中其含量维持在107～1011copies/mL。种水平上，优势菌是消化乳杆菌和植物乳杆菌。真菌群落中共检测到5个属，包括德巴利氏酵母菌属、假丝酵母属、酵母属、柯达酵母属、Cystofilobasidium，其中德巴利氏酵母属是优势真菌属。另外，本研究还发现，微生物群落结构与发酵进程具有相关性，因此不同发酵阶段优势菌属不同。

利用PCR-DGGE和qPCR技术能够分析出工业青菜泡菜发酵过程中的微生物群落结构，本次研究结果能够为提高工业化泡菜的质量和规模提供技术支持。