草鱼下脚料制备鱼酱油的酶解工艺优化

王正云，蒋慧亮，渠柳柳

(江苏农牧科技职业学院，江苏 泰州 225300)

利用低值鱼和水产加工下脚料中残留的蛋白质资源制备富含氨基酸和多肽的调味品一直是国内外研究的热点[1]。鱼酱油也称鱼露、虾油，它是以鱼、虾为原料酿制而成的一种调味品，其营养价值高，具有独特的风味，深受国内外人们的喜爱[2，3]。本研究以溱湖草鱼加工下脚料为研究对象，研究草鱼下脚料发酵鱼酱油酶解工艺，以期为草鱼下脚料的综合利用途径提供试验依据[4]。

1 材料与方法

1.1 材料

鱼头、鱼皮、鱼骨及鱼肉等草鱼下脚料均来自泰州溱湖。

风味蛋白酶(20 U/g)、中性蛋白酶(100 U/g)：购自扬州试剂公司；米曲霉3.042：购于上海佳民酿造食品有限公司；其他试剂：均为分析纯。

1.2 主要试验仪器

AL204分析天平、EL20K精密pH计 梅特勒-托利多仪器有限公司；CM-14(2-11-0294)斩拌机 无锡市哈克逊工贸有限公司；Color Squid磁力搅拌器 上海科升仪器有限公司；HPX-9162电热恒温培养箱、凯氏定氮蒸馏装置等。

1.3 试验方法

1.3.1 鱼酱油制作工艺

草鱼下脚料清洗、绞碎→盐渍→复合蛋白酶酶解→蒸煮灭酶→接入种曲恒温发酵→离心→调配→脱腥→再离心→灭菌→鱼酱油成品。

1.3.2 操作要点

1.3.2.1 清洗、绞碎

将加工后的草鱼下脚料清洗干净后，按照设定的固液比加入蒸馏水，放入高速组织捣碎机中绞成匀浆。

1.3.2.2 盐渍

按照原料重量，加入10%的食盐，以抑制酶解液的腐败变质，增加风味。

1.3.2.3 复合蛋白酶酶解

调节体系pH为7.5,加入复合蛋白酶(风味蛋白酶∶中性蛋白酶为1∶1)进行保温酶解[5]。

1.3.2.4 蒸煮灭酶

酶解结束后，对酶解液进行蒸煮，并保持10 min，进行灭酶。

1.3.2.5 恒温发酵

接入0.2%驯化后的米曲霉种曲，于37 ℃条件下保温发酵10天。

1.3.2.6 离心

在转速为4000 r/min条件下离心15 min，以除去酶解液中的脂肪、不溶物和沉淀物，取上清液。

1.3.2.7 调配

根据配方需要加白砂糖等其他辅料进行调配。

1.3.2.8 脱腥

加入1%活性干酵母在35～37 ℃条件下作用1 h进行脱腥。

1.3.2.9 再离心

再次离心除去脂肪、不溶物和沉淀物。

1.3.2.10 灭菌

将制作好的鱼酱油装瓶进行杀菌，采用HTST杀菌方法，在100 ℃下灭菌 15 min，冷却至室温，制成鱼酱油成品。

1.3.3 单因素试验设计

在预试验基础上，以复合蛋白酶(风味蛋白酶∶中性蛋白酶为1∶1)为研究对象，以氨基酸态氮含量为评价指标，分别讨论酶的添加量、酶解温度、酶解时间、固液比对鱼酱油品质的影响。

1.3.3.1 酶的添加量对鱼酱油品质的影响

在酶解温度40 ℃、酶解时间1 h、固液比1∶1的条件下分别添加0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%的复合蛋白酶，研究酶的添加量对鱼酱油的影响。

1.3.3.2 酶解温度对鱼酱油品质的影响

在复合酶添加量为0.3%、酶解时间1 h、固液比1∶1的条件下酶解温度分别为35，40，45，50，55，60 ℃，研究酶解温度对鱼酱油品质的影响。

1.3.3.3 酶解时间对鱼酱油品质的影响

在酶解温度40 ℃、复合酶的添加量0.3%、固液比1∶1的条件下分别酶解1，2，3，4，5，6 h，研究酶解时间对鱼酱油品质的影响。

1.3.3.4 固液比对鱼酱油品质的影响

在酶解温度40 ℃、复合酶的添加量0.3%、酶解时间1 h的条件下固液比分别为1∶0.5、1∶0.75、1∶1、1∶1.25、1∶1.5、1∶1.75，研究固液比对鱼酱油品质的影响。

1.3.4 正交试验设计

在单因素的基础上，选取酶的添加量，酶解温度，酶解时间、固液比4个影响因素为研究对象，进行四因素三水平正交试验设计，确定鱼酱油的最佳酶解条件。

1.4 鱼味酱油的检测方法

1.4.1 鱼味酱油的理化检测方法

1.4.1.1 可溶性无盐固形物的测定

按照SB/T 10326—1999 《无盐固形物测定法》，结果以每 100 mL 样品中所含可溶性无盐固形物的克数表示[6]。

1.4.1.2 全氮的测定

按照 GB 5009.5—2016《食品中蛋白质的测定》中凯氏定氮法进行测定，结果以每 100 mL 样品中所含氮的克数表示[7]。

1.4.1.3 氨基酸态氮的测定

按照 GB 5009.235—2016《食品中氨基酸态氮的测定》中甲醛值法进行测定，结果以每 100 mL 样品中所含氮的克数表示[8]。

1.4.2 鱼味酱油的微生物检测方法

1.4.2.1 菌落总数的测定

按照GB 4789.2—2016《食品微生物学检验 菌落总数测定》中平板计数法对鱼味酱油进行测定[9]。

1.4.2.2 大肠菌群的测定

按照GB 4789.3—2016《食品微生物学检验 大肠菌群计数》规定方法检测[10]。

2 结果与分析

2.1 酶的添加量对鱼酱油品质的影响

酶的添加量对鱼酱油品质的影响结果见图1。

图1 酶的添加量对鱼味酱油品质的影响Fig.1 Effect of additive amount of enzyme on quality of fish sauce

由图1可知，复合蛋白酶的酶解能力很强，鱼味酱油中氨基酸态氮含量随着酶的添加量增加而逐步升高，当酶的添加量为0.3%时达到最高值。这是因为复合蛋白酶加快了鱼味酱油发酵中蛋白质的水解，使鱼味酱油风味大大改善[11]。但当酶的添加量大于0.3%时鱼味酱油中的氨基酸态氮含量反而降低，这可能是因为蛋白质水解度太大反而会影响鱼味酱油的风味，因此酶的添加量为0.2%～0.3%比较适宜。

2.2 酶解温度对鱼酱油品质的影响

酶解温度对鱼酱油品质的影响结果见图2。

图2 酶解温度对鱼酱油品质的影响Fig.2 Effect of enzymolysis temperature on quality of fish sauce

由图2可知，随着酶解温度的升高，鱼味酱油中的氨基酸态氮含量也逐步增加，温度过低时降低了酶解和蛋白质分解，所以氨基酸态氮含量比较低，当温度达到50 ℃时氨基酸态氮含量最高，当酶解温度大于50 ℃时氨基酸态氮含量逐渐降低，温度太高会破坏酶活力，从而影响氨基酸态氮的产生[12]。

2.3 酶解时间对鱼酱油品质的影响

酶解时间对鱼酱油品质的影响结果见图3。

图3 酶解时间对鱼酱油品质的影响Fig.3 Effect of enzymolysis time on quality of fish sauce

由图3可知，在酶解时间2 h内，氨基酸态氮含量呈现上升趋势，酶解2 h后，氨基酸态氮含量反而略有下降，说明酶已与底物充分反应，酶解基本完成，因此，为提高酶解效率，最适酶解时间选择在2 h左右[13]。

2.4 固液比对鱼酱油品质的影响

固液比对鱼酱油品质的影响结果见图4。

图4 固液比对鱼酱油品质的影响Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on quality of fish sauce

由图4可知，固液比较低时氨基酸态氮含量相对较高，随着固液比的升高，氨基酸态氮含量逐渐降低。但固液比太低会造成固液混合不均匀，使复合蛋白酶水解蛋白质不充分，而造成原料的损失，增加成本，因此选择固液比为1∶0.5～1∶1进行正交试验设计。

2.5 酶解条件优化

基于单因素试验选择3个最适宜的水平进行正交试验，正交试验因素水平表见表1，正交试验结果见表2。

表1 正交试验因素及水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

表2 正交试验分析结果表Table 2 Results of orthogonal analysis

采用L9(34)正交试验确定鱼酱油的最佳酶解工艺，由表2可知，酶的添加量(A)、酶解温度(B)、酶解时间(C)、固液比(D)4个因素对鱼酱油影响的主次关系为A>D>C>B,最佳的工艺条件为A2B3C1D2。即酶的添加量0.3%，酶解温度50 ℃，酶解时间1 h，固液比1∶0.75。

应用SPSS 17.0统计软件对正交试验结果进行方差分析，结果见表3。

表3 正交试验方差结果Table 3 Variance results of orthogonal test

注：“*”表示该因素的各水平差异在a=0.05时显著。

由表3可知，在影响氨基酸态氮含量的4个因素中，酶的添加量和固液比均有显著的影响，酶解温度和酶解时间对氨基酸态氮含量的影响均不显著，这与极差分析的结果基本相符。

2.6 鱼酱油的理化和卫生指标[14,15]

产品呈橙红色或橙黄色；澄清透明，无悬浮物和沉淀物；具有鱼味酱油固有香味，无异味和臭味；口感咸鲜，入口滑爽，符合二级酱油国家标准。产品的理化指标和卫生指标见表4和表5。

表4鱼酱油的理化检测结果
Table4Physicochemicaltestresultsoffishsauce

检测项目 检测结果标准要求(GB 18186—2000《酿造酱油》)特级一级二级三级可溶性无盐固形物(g/dL)≥16.8520.0018.0015.0010.00全氮(以氮计,g/dL)≥1.221.601.401.200.80氨基酸态氮(以氮计,g/dL)≥0.620.800.700.600.44

表5 鱼酱油的微生物检测结果Table 5 Microbial test resuts of fish sauce

3 结论

本实验以淡水鱼下脚料为原料，在外加酶和保温发酵的条件下研制鱼酱油。对酶的添加量、酶解温度、酶解时间、固液比进行单因素试验，并在单因素试验基础上进行正交试验，确定鱼酱油的最佳酶解条件为：酶的添加量0.3%，酶解温度50 ℃，酶解时间1 h，固液比1∶0.75。

该酶解条件下结合最佳保温发酵制作出的鱼酱油呈橙红色或橙黄色；澄清透明，无悬浮物和沉淀物；具有鱼味酱油固有香味，无异味和臭味；口感咸鲜，入口滑爽，符合二级酱油国家标准。