低水平乙型肝炎病毒DNA 慢性乙型肝炎患者血清乙型肝炎病毒RNA 水平及其影响因素研究

彭亚梦，袁浩*，周毅峰，龙贞亦，吴思弦

目前乙型肝炎病毒（HBV）感染仍是全球最严重、最普遍的健康问题之一［1］。每年因HBV 感染而导致其肝功能失代偿、肝硬化、肝衰竭及肝细胞癌等相关疾病死亡的患者有50 万～120 万人［2-3］。导致HBV 持续性感染的根本原因是共价闭合环状DNA（cccDNA）的持续性存在［4］，现有的血清标志物和病毒学复制分子学检测难以准确反应肝细胞内cccDNA 的存在状态，有研究表明尽管慢性乙型肝炎（CHB）患者血清中HBV DNA 为低浓度状态，但体内cccDNA 仍复制活跃，且其肝脏组织学证据仍提示有炎症及纤维化倾向［5］。监测肝组织内cccDNA 需要进行肝组织活检，临床上难以连续实施，肝组织内cccDNA 分布不均以及松弛环状双链DNA（rcDNA）的存在也为其检测增加了难度［6］。

2017年欧洲肝病研究协会（EASL）新发布的临床实践指南将血清HBV RNA 定义为一种新型的血清标志物，并指出其主要成分前基因RNA（pgRNA）以病毒样颗粒释放入血［1］。pgRNA 为cccDNA 的直接转录体，能精确地反映肝细胞中cccDNA 的存在状态，血清HBV RNA 的检测将为CHB 患者体内病毒复制状态及其治疗效能提供更为直接的证据［7］。为此，本研究探讨当CHB 患者血清HBV DNA 处于低复制水平时，血清HBV RNA 的存在状态、影响因素，旨在为临床诊治CHB 提供新思路。

本研究创新点：

血清乙型肝炎病毒（HBV）RNA 为一种新型的血清标志物，其主要成分前基因RNA（pgRNA）为共价闭合环状DNA（cccDNA）的直接转录体，能精确地反应肝细胞中cccDNA 的存在状态。血清HBV RNA作为检测HBV 感染的一项新的血清标志物，其在不同乙肝e 抗原（HBeAg）状态的患者中，与其他血清标志物的相关性等问题研究较少，本文就这一问题进行了探讨，结果表明血清HBV RNA 在不同HBeAg 状态的患者中存在较大差异，且与其他血清标志物存在一定的相关性。下一步将深入分析不同药物治疗下血清HBV RNA 水平的动态变化等问题。

1 对象与方法

1.1 研究标准 纳入标准：符合《慢性乙型肝炎防治指南（2015年更新版）》（以下简称《防治指南》）［8］中的相关诊断标准；明确HBV 感染至少6 个月；血清HBV DNA＜1.0×104U/ml。排除标准：其他嗜肝病毒感染；酒精性肝病；非酒精性脂肪性肝病；药物性肝病；代谢性肝病及自身免疫性肝病，或其他原因所导致的肝损伤；HIV 感染者；原发性胆汁性肝硬化患者［8］。

1.2 研究对象 回顾性选取2018年5—7月于湖南师范大学附属第一医院湖南省人民医院确诊且符合研究标准的CHB 患者。患者均处于HBV DNA 低水平状态，入院后均按照《防治指南》［8］进行治疗。本研究患者均对本研究知情同意。

1.3 方法

1.3.1 样本采集及处理 采集患者清晨空腹静脉血 5 ml，加入抗凝管中，4000 r/min 离心10 min（离心半径10 cm）后收集上清液，分装于1.5 ml 无酶EP 管中，置于-80 ℃保存待检。

1.3.2 HBV 血清标志物（HBV-M）检测 采用北京万泰生物技术有限公司生产的全自动化学发光免疫分析仪Caris200，试剂为购于厦门万泰凯瑞生物技术有限公司的乙型肝炎诊断试剂盒，应用化学发光微粒子免疫检测法进行检测，其中乙肝表面抗原定量（qHBsAg）检测有效范围为0.05～250.00 U/ml，乙肝e 抗原（HBeAg）为定性检测。

1.3.3 肝功能指标的检测 采用贝克曼5800 全自动生化分析仪，试剂购自上海科华生物工程股份有限公司。以血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）作为观察指标，二者均应用双试剂速率法进行检测。

1.3.4 血清HBV DNA 检测 采用上海宏石医疗科技有限公司生产的 SLAN Real-Time PCR Detection System 96荧光定量检测仪，试剂购自湖南圣湘生物科技股份有限公司，应用qPCR 法，由获得PCR 上岗证工作人员严格按说明书操作进行检测。该试剂盒检测下限为1.0×102U/ml。

1.3.5 血清HBV RNA 的检测 采用上海宏石医疗科技有限公司生产的SLAN Real-Time PCR Detection System 96 荧光定量检测仪，试剂购自湖南圣湘生物科技股份有限公司，应用RT-qPCR 法，由获得PCR 上岗证工作人员严格按说明书操作进行检测。该试剂盒的检测下限为0.5×102U/ml。

1.4 观察指标 依据患者HBeAg 情况将患者分为HBeAg 阳性患者和HBeAg 阴性患者，比较其年龄、性别、血清ALT 水平、血清AST 水平、血清qHBsAg 水平、血清HBV DNA 水平、血清HBV RNA 水平、血清HBV RNA 水平低于检测下限发生率，分析CHB 患者血清HBV RNA 水平及其低于检测下限的影响因素，以及血清HBV RNA 水平与ALT、AST、qHBsAg、HBeAg、HBV DNA 的相关性。

1.5 统计学方法 采用 SPSS 19.0 统计学软件进行数据处理，GraphPad Prism 6.0 绘制统计图。CHB 患者血清标志物数据均进行对数转换（log）。符合正态分布的计量资料以（±s）表示，两组间比较采用成组t 检验；相关性分析采用Pearson 相关分析；非正态分布的计量资料经对数转换后以M（P25，P75）表示，组间比较采用Mann-Whitney U 检验，相关性分析采用Spearman 秩相关分析；计数资料以相对数表示，组间比较采用χ2检验；采用线性回归分析及多因素Logistic 回归分析血清HBV RNA 水平及其低于检测下限的影响因素。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CHB 患者临床资料 本研究共纳入HBV DNA 检测处于低水平状态的CHB 患者72 例，平均年龄为（49.5±13.5）岁；男46 例，女26 例；HBeAg 阳性12 例，HBeAg 阴性60 例。HBeAg 阳性与HBeAg 阴性患者性别、血清ALT 水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；HBeAg 阳性患者年龄小于HBeAg 阴性患者，血清AST、qHBsHg、HBV RNA 水平高于HBeAg 阴性患者，血清HBV DNA 水平、血清HBV RNA 水平低于检测下限发生率低于HBeAg 阴性患者，差异有统计学意义（P＜0.05，见表1）。

2.2 CHB 患者血清HBV RNA 水平的影响因素分析 分别以年龄（赋值：连续性变量）、性别（赋值：男=1，女=2）、ALT（赋值：连续性变量）、AST（赋值：连续性变量）、qHBsAg（赋值：连续性变量）、HBeAg（赋值：HBeAg 阴性=0，HBeAg 阳性=1）、HBV DNA（赋值：连续性变量）为自变量，以血清HBV RNA 为因变量（赋值：连续性变量）进行单因素线性回归分析，结果显示，年龄、qHBsAg、HBeAg 是CHB 患者血清HBV RNA 水平的影响因素（P＜0.05）。将单因素分析中P＜0.200 的自变量纳入多因素线性回归分析，结果显示，HBeAg 是CHB 患者血清HBV RNA 水平的影响因素（P＜0.05，见表2）。

表2 CHB 患者血清HBV RNA 水平影响因素的单因素和多因素线性回归分析Table 2 Univariate and multivariate linear regression analysis of factors influencing serum HBV RNA levels in CHB patients

表1 HBeAg 阳性与HBeAg 阴性患者临床资料比较Table 1 Comparison of clinical data between HBeAg positive and HBeAg negative patients

2.3 CHB 患者血清HBV RNA 水平低于检测下限的影响因素分析 以年龄（赋值：连续性变量）、性别（赋值：男=1，女=2）、ALT（赋值：连续性变量）、AST（赋值：连续性变量）、qHBsHg（赋值：连续性变量）、HBeAg（赋值：HBeAg 阴性=0，HBeAg 阳性=1）、HBV DNA（赋值：连续性变量）为自变量，以CHB 患者血清HBV RNA 是否低于检测下限（赋值：是=1，否=0）为因变量，进行多因素Logistic 回归分析，结果显示，qHBsAg〔OR=1.682，95%CI（1.055，2.681），P=0.029〕、HBeAg〔OR=3.85，95%CI（1.068，13.880），P=0.039〕是CHB 患者血清HBV RNA 水平低于检测下限的影响因素。

2.4 CHB 患者血清HBV RNA 水平与ALT、AST、qHBsAg、HBeAg、HBV DNA 的相关性分析 CHB 患者血清中ALT 为1.44（1.21，1.74）U/L，AST 为1.43（1.29，1.68）U/L，qHBsAg 为2.87（1.34，3.33）U/ml，HBV DNA 为2.85（2.39，3.19）U/ml，HBV RNA 为1.70（1.70，1.95）U/ml。CHB 患者血清HBV RNA 水平与qHBsAg（rs=0.322，P=0.006）、HBeAg（rs=0.235，P=0.047）相关，与ALT（rs=0.038，P=0.752）、AST（rs=0.189，P=0.557）、HBV DNA（rs=0.058，P=0.629）水平均无相关关系。

在HBeAg 阳性患者中，血清HBV RNA 水平与qHBsAg（rs=0.848，P＜0.001）、HBeAg（rs=0.725，P=0.008）相关，与ALT（rs=0.051，P=0.876）、AST（rs=0.046，P=0.702）、HBV DNA（rs=0.383，P=0.219）无相关关系。在HBeAg 阴性患者中，血清HBV RNA 水平与ALT（rs=-0.020，P=0.878）、AST（rs=-0.080，P=0.542）、qHBsAg（rs=0.151，P=0.251）、HBeAg（rs=0.083，P=0.529）、HBV DNA（rs=0.145，P=0.268）均无相关关系。

3 讨论

目前CHB 患者的治疗仍面临着停药难、易反弹等难题，现有的血清标志物难以准确反映肝细胞内cccDNA 的存在状态［9］。1996年德国学者KOCK 等在研究HBV 是否能感染人外周单个核细胞时在CHB 患者血清中检测到了HBV RNA［10］。近年来，国内外学者对于血清HBV RNA 进行了广泛研究，不断改进和优化其检测方式，同时对其临床意义进行了深入探 索［7，9，11-12］。

《防治指南》［8］提出CHB 患者治疗的理想终点是HBeAg 阳性和HBeAg 阴性的患者停药之后实现持久的HBsAg 清除，伴或不伴HBsAg 的血清学转换。然而HBsAg 并不能完全代表肝细胞内HBV 的复制情况，在实际治疗过程中HBsAg 转阴率并不理想。本研究比较了当HBV DNA 低水平状态时，在HBeAg 阳性和 HBeAg 阴性的CHB 患者血清HBV RNA 水平，并发现二者血清HBV RNA 水平差异显著。本研究结果显示，HBeAg 阳性患者年龄小于HBeAg 阴性患者，与杨建功等［13］得出的HBeAg 阴性发生率与年龄有关的结果相似。进一步进行影响因素分析结果显示，HBeAg 是CHB 患者血清HBV RNA 水平的影响因素。相关性分析显示，CHB 患者血清HBV RNA 水平与HBeAg 相关；且在HBeAg 阳性患者中，血清HBV RNA 水平与HBeAg 相关，表明血清HBV RNA 水平能较准确反应CHB 患者体内病毒的复制状态。HUANG 等［14］研究发现，在应用核苷及核苷酸类药物（NAs）治疗过程中，血清HBV RNA 水平或可作为预测HBeAg 发生血清学转换的血清标志物［15］。

虽然从一定程度上来说，HBV DNA 也能反映体内cccDNA 的复制活性，且HBV RNA 的低检出率是与此现象一致的，然而，HBV DNA 低于检测下限仅表明该病毒的反转录过程被抑制，并不能反映cccDNA 的转录状态，在反转录过程被抑制后，cccDNA 仍以HBV RNA 病毒样颗粒的形式产生子代病毒，因此以现有病毒学应答为前提条件停药后，疾病反弹和复发率较高［5，16-18］。 本研究结果显示，CHB 患者血清HBV DNA 水平与血清HBV RNA 水平无相关关系，且在不同HBeAg 状态的患者中，其血清HBV DNA 水平与血清HBV RNA 水平也无直线相关关系。这表明尽管HBV DNA 处于低水平或低于检测下限的状态，cccDNA 仍存在复制活性，导致HBV RNA 被检出或处于较高水平。因此，HBV RNA 相较于HBV DNA 更能精确反应cccDNA 的存在状态，能为CHB 患者抗病毒治疗效果提供更有力的证 据［5，19-20］。

HBeAg 阴性患者血清HBV RNA 水平低于检测下限的发生率高于HBeAg 阳性患者，可能是HBeAg 阳性患者体内cccDNA 转录活性相较于HBeAg 阴性患者活跃所导致，与其他学者的相关研究结论一致［21］。多因素Logistic 回归分析结果显示，qHBsAg 和HBeAg 是CHB患者血清HBV RNA 水平低于检测下限的影响因素。本研究中CHB 患者血清HBV RNA 水平高于检测下限的总检出率为32%（23/72），与HUANG 等［18］研究中的检出率相近，而LI 等［22］研究中的检出率却高达85.3%，该差异可能来源于样本选取、人口学特征以及方法学等方面。

本研究结果显示，HBeAg 阳性患者血清HBV RNA水平与HBeAg 相关，而在HBeAg 阴性患者中二者并无相关关系，这可能是由于HBeAg 不仅来自cccDNA，还可由整合的HBV 基因片段合成。研究表明，在HBV 感染的患者中，携带HBV DNA 整合片段的肝细胞大约占总肝细胞的1%，HBV DNA 整合后转录翻译出HBeAg，这可能是临床上导致其无法彻底清除的重要原因［23-24］。因此，HBeAg 对于评判患者是否达到临床治愈水平有一定缺陷，而血清HBV RNA 为cccDNA 的直接转录体，相较于HBeAg 更能直接反应目前体内cccDNA 的复制活性。有学者建议将HBV RNA 纳入临床诊断、疾病进展监测和抗病毒药物合理化停药的应用中［25-27］。然而，其作为一项成熟的血清标志物运用于临床还需要准确性、灵敏度更高，更加标准化的检测方法以及进行更完善的前瞻性研究。

综上所述，不同HBeAg 情况的低水平HBV DNA CHB 患者血清HBV RNA 水平存在较大差异，HBeAg 是CHB 患者血清HBV RNA 水平的影响因素，HBeAg、qHBsAg 是CHB 患者HBV RNA 低于检测下限的影响因素。同时CHB 患者血清HBV RNA 水平与其他血清标志物存在一定的相关性。因此说明，低水平HBV DNA CHB 患者血清HBV RNA 水平一定程度上可反应CHB患者体内病毒的活跃状态，可作为检测HBV 感染的一项新的血清标志物。