探讨“利用淀粉酶探究温度对酶活性的影响”实验检测试剂的选择

福建省石狮市第三中学(362700) 谢仁荣

四川省绵竹市南轩中学(618200) 申定健

安徽省芜湖市第十二中学(241002) 吴志强

人教版生物教材关于“酶的特性”相关内容的教学中，设置了探究实验“影响酶活性的条件”，建议“用淀粉酶探究温度对酶活性的影响”，所提供的材料用具中有碘液和斐林试剂。在实验教学中经常运用碘液检测底物淀粉的水解程度，但是能否用斐林试剂检测产物还原糖的生成在中学教学中产生了很大争议。大部分教师对此持反对意见，认为本实验需要严格控制温度，而斐林试剂检测还原糖时需要加热，在加热过程中，酶的活性可能发生变化，原来设置的低温条件(如2～4℃)酶活性很低，淀粉水解速度很慢，产生的还原糖很少，几乎无法与斐林试剂生成砖红色沉淀，加热升高温度，酶活性可能随之升高，反应生成较多还原糖，因而可能出现砖红色沉淀，从而影响实验效果。

1 经典例题分析

例题：为探究NaCl和CuSO4对唾液淀粉酶活性的影响，某同学进行了实验，实验步骤和结果见表1。

表1 实验步骤和结果1

分析实验结果可知：对酶活性有影响的离子是Cl－和Cu2＋，其中对酶活性有抑制作用的离子是Cu2＋，对酶活性有促进作用的离子是Cl－。

上述实验中若用斐林试剂代替碘溶液进行检测，1～4号试管中的颜色依次是深砖红色、无砖红色(或蓝色)、浅砖红色、浅砖红色。根据上述实验结果，在操作过程中，保温之前不能加入斐林试剂，其原因是斐林试剂中有Cu2＋，其可抑制唾液淀粉酶的活性。

对试题中所描述的结果，有学生提出一些自己的看法，设计以下实验。实验方法与步骤如上所述，实验结果与试题内容一致。另增加5、6、7组实验，5号试管中加入0.05g/mL的 CuSO4溶液1mL，6号试管中加入0.1g/mL的NaOH溶液1mL，7加入1mL新配置的斐林试剂，其他步骤如试题所述步骤进行。在保温时间长达1h后，在6、7号试管中先加入适量盐酸，中和NaOH至溶液pH为6或7，再加入数滴碘液，5、6、7组实验现象均为深蓝色。本实验验证了0.05g/mL的CuSO4溶液、0.1g/mL的NaOH溶液和斐林试剂均能抑制唾液淀粉酶活性。

2 利用唾液淀粉酶探究温度对酶活性的影响，用碘液检测底物淀粉

利用唾液淀粉酶探究温度对酶活性的影响，用碘液检测淀粉的实验步骤及结果见表2。

表2 实验步骤和结果2

37℃条件下，唾液淀粉酶活性较高，经过5min保温后，淀粉被分解，无法与碘液发生显色反应。冰水浴唾液淀粉酶活性虽较低，但恢复到37℃后仍能恢复活性，水解淀粉(甲组)；而96℃沸水浴后(恒温水浴锅只能达到96℃)唾液淀粉酶没有活性，迅速降到37℃后再保温5min后(戊组)，加入碘液仍呈深蓝色，与丁组一致，验证了唾液淀粉酶在高温(96℃)下空间结构被破坏，酶活性不能恢复。需要注意的是，丁组和戊组加入碘液后都变蓝色，但蓝色马上消失，这与淀粉在较高温度下，因结构伸展不与碘结合，显色较浅甚至不显色有关，在冷却到常温时又可恢复到蓝色。

延长乙组冰水浴和丁组沸水浴时间，乙组蓝色逐渐变浅，说明冰水浴低温条件下，唾液淀粉酶的活性虽受抑制，但仍有一定活性，淀粉仍能缓慢水解；而丁组长时间保温后冷却再加入碘依然是深蓝色，说明96℃条件下唾液淀粉酶的活性已完全丧失。

3 利用唾液淀粉酶探究温度对酶活性的影响，用斐林试剂检测产物还原糖

用斐林试剂(0.1g/mL的 NaOH 溶液与0.05g/mL的CuSO4溶液等量混合，现配现用)检测产物还原糖的生成，实验步骤及结果见表3。

各实验组与斐林试剂96℃水浴数分钟后，丙组出现砖红色沉淀，而乙、丁组都不出现砖红色沉淀，说明2～4℃冰水浴组及96℃沸水浴组唾液淀粉酶活性都很低，在反应时间内(45min)都没有产生足量的还原糖。将乙组冰水浴保温时间延长到3h后，与斐林试剂96℃沸水浴数分钟后，乙组也出现了微量的砖红色沉淀；而将冰水浴时间延长到20h，则可以出现明显的砖红色沉淀。说明在2～4℃冰水浴条件下，酶仍有活性，能缓慢水解淀粉，生成还原糖。甲组和戊组实验结果也说明2～4℃低温条件下唾液淀粉酶活性较低，但温度恢复到合适温度时酶活性仍能升高，而96℃高温作用下唾液淀粉酶活性丧失，并且降低温度到合适温度酶活性也不能恢复。值得注意的是，甲组的砖红色沉淀较丙组少，这可能说明冰水浴对唾液淀粉酶活性还是有一定程度的影响。

表3 实验步骤和结果3

4 实验结果进一步分析

本实验在37℃温水浴中保温5～20min，利用斐林试剂检测还原糖，没有观察到砖红色沉淀，当将保温时间延长到30min以上时，才在实验中观察到砖红色沉淀(量很少)。笔者验证过斐林试剂与还原糖(葡萄糖)反应，质量分数为0.05%的葡萄糖溶液都可较快地出现明显的砖红色沉淀，其灵敏性是很高的。

分析其原因可能与唾液淀粉酶的作用机制有关。唾液中所含的淀粉酶属于α－淀粉酶，α－淀粉酶能作用于直链淀粉和支链淀粉，以及糖原、其他多聚糖和寡聚糖，随机地从底物分子内部切断α－1，4糖苷键，但不能切断α－1，6糖苷键及α－1，6糖苷键附近的α－1，4糖苷键。因而α－淀粉酶作用于淀粉首先产生分子大小不一的中间产物糊精，引起底物溶液粘度的急剧下降和碘反应的消失，但还原糖的生成是需要较长时间的。随作用的时间延长，糊精进一步分解，聚合度逐渐降低，还原性的葡萄糖末端逐渐增多，最终产生含有寡糖和带有支链的寡糖、麦芽糖、α－1，4葡萄糖等。

用碘液检测淀粉的分解和用斐林试剂检测淀粉的水解产物还原糖的生成，两者的衡量指标是不同的，前者随着唾液淀粉酶或α－淀粉酶作用，很快就丧失与碘的呈色作用，而且反应灵敏，可用于定性及定量测定淀粉的水解情况；而淀粉初步水解的产物糊精基本没有还原性，需要作用更长的时间，直至有足够量的还原糖生成，才能检测出砖红色的沉淀。在本实验条件下将作用时间延长到45min以上，效果才较为明显。

5 与斐林试剂反应的水浴温度影响

斐林试剂检测还原糖时需要加热，人教版必修1教材给出的水浴加热温度是50～65℃，而人教新课标版教材必修3和人教大纲版教材是沸水浴或用酒精灯直接加热，上述试题也是用沸水浴加热，唾液淀粉酶在50～65℃依然有一定活性，加热温度对此实验是否有影响?

再设置一组实验：将与斐林试剂混合后的沸水浴改为60℃水浴，其他条件与步骤同表3中乙组步骤，在相应温度下保温45min，乙组未出现砖红色沉淀；将保温时间延长到3h，再与斐林试剂混合，60℃水浴30min也未出现砖红色沉淀。分析其原因可能是冰水浴条件下，淀粉水解的速度很慢，生成的还原糖太少，而60℃水浴时斐林试剂与还原糖反应生成砖红色氧化亚铜沉淀的速度也较慢，而很难观察到沉淀。这点在斐林试剂与葡萄糖的验证实验中也有体现，在60℃水浴加热条件下，0.05%的葡萄糖组几乎观察不到砖红色沉淀，0.1%的葡萄糖组才能观察到微量的砖红色沉淀，而且生成沉淀的速度比沸水浴组明显慢得多，沉淀的量也较少，需要加热较长时间。

6 结论与展望

“利用淀粉酶探究温度对酶活性的影响”实验中用斐林试剂检测产物还原糖的生成是可行的。其原因是加入斐林试剂时，酶活性就被抑制了，不管是在沸水浴还是60℃水浴条件下。而在合适的反应时间(如30～45min)内，加热时间30min以上也未出现砖红色沉淀。但该反应需要较长时间(30min以上)，与斐林试剂混合后的水浴温度也以沸水浴为佳，反应较快，效果较好。上述高考试题的设置十分严谨，并没有科学问题。而在实际操作中，仍建议以碘液来检测底物淀粉的水解，更简单易行，效果也更好。下一步将摸索合适的反应条件，将反应时间缩短到合理范围，以便在教学中运用。