炮制对小茴香中黄酮成分的影响*

李 敏，窦志英，柴 欣，王跃飞，杨 静

（天津中医药大学中医药研究院，天津市现代中药重点实验室，天津 301617）

小茴香为伞形科植物茴香（Foeniculum vulgare Mill.）的干燥成熟果实，主产于甘肃、宁夏、新疆、内蒙古等省[1]，是一种药食同源的植物。其性温，味辛，有散寒止痛、理气和胃的功效；主要用于治疗寒疝腹痛，睾丸偏坠，痛经，少腹冷痛，脘腹胀痛，食少吐泻，睾丸鞘膜积液等[2]。盐小茴香是小茴香采用盐水炙法炒至微黄色，具有暖肾散寒止痛之功效[3]。

小茴香的化学成分主要包括挥发性成分和非挥发性成分。挥发性成分是小茴香的重要活性成分，占3%~6%[4]，主要包括单萜、倍半萜及含氧化合物，其中反式-茴香脑、爱草脑、L-葑酮、D-柠檬烯是小茴香主要挥发性成分，具有抗炎、镇痛、抑菌、保肝、促渗、降血糖、抗癌等作用[5-8]。非挥发性成分主要包括酚酸和黄酮类成分，酚酸类化合物具有抗氧化作用，可以清除氧自由基，减轻对机体的损伤[9]；黄酮类成分具有多种活性，紫丁香苷（SG）具有抗炎、抗辐射、抗癌、增强记忆力、缓解疲劳等作用[10]；槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷（QG）具有抗动脉粥样硬化、抗炎、抗病毒等活性[11-12]。

2015年版《中华人民共和国药典》采用气相色谱法测定了挥发性成分反式茴香脑，未开展小茴香中非挥发性成分的分析。本研究以SG、QG为指标成分，系统研究盐制小茴香炮制过程中指标成分的变化规律以及市售小茴香中指标成分的含量分布情况，为小茴香质量控制及炮制研究提供实验依据。

1 材料

1.1 仪器 超高效液相色谱仪：Waters ACQUITYTMUPLC system（美国沃特世公司），XS 205型十万分之一电子天平（瑞士Mettler-Toledo公司），AL 204型电子天平（瑞士Mettler-Toledo公司），DL-180E型智能超声波清洗器（上海之信仪器有限公司，功率180 W，频率50 kHz），TGL-16C型高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂），Milli-Q型超纯水系统（美国Millipore公司），HYC-940医用冷藏箱（青岛海尔特种电器有限公司），C21-WK2102多功能电磁炉（Midea公司），CKN4634BF-无油烟炒锅（浙江炊大王炊具有限公司）。

1.2 药品与试剂 紫丁香苷（111574-201605）购自中国食品药品检定研究院、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷（R24S7F21842）购自上海源叶生物科技有限公司。

小茴香：16批药材购自河北安国、安徽亳州等大型中药材交易市场，样品编号S-1~S-10（生小茴香）；Y-1~Y-6（盐小茴香）。生品小茴香 S-10（购自河北春开制药股份有限公司，产地：内蒙古）用于盐小茴香的炮制研究。所有样品均由天津中医药大学李天祥教授鉴定为伞形科植物茴香（Foeniculum Vulgaer Mill.）的干燥成熟果实。

甲醇为色谱纯，甲酸为分析纯，水为超纯水；食用盐（芦花，天津长芦汉沽盐场有限责任公司）。

2 方法

2.1 色谱条件 色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7μm）；流动相：0.1%甲酸水溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脱（0～7 min，5%→36.5%B；7～12 min，36.5%→85%B）；柱温：40 ℃；流速：0.3 mL/min；检测波长：254 nm；进样量：2 μL。

2.2 对照品溶液制备 分别取SG、QG标准品适量，精密称定，配制成浓度分别为99.30μg/mL、123.76μg/mL的混合对照品溶液，置于4℃冰箱中，备用。

2.3 供试品溶液制备 取小茴香药材粉末0.5 g，精密称定，置于25 mL容量瓶中，加适量50%甲醇，超声处理（频率50 kHz）20 min，放至室温，加50%甲醇定容至刻度，摇匀，14 000 rpm离心10 min，取上清液，过滤，取续滤液1 mL，加1 mL蒸馏水，混匀，即得供试品溶液。

2.4 盐小茴香炮制研究 取生小茴香药材1 kg，置于炒锅中，均匀翻炒，炒至微显火色，喷淋盐水溶液继续翻炒至微干，取出，放凉，即得。本研究系统考察了小茴香盐炙过程中的盐水比例（20 g分别溶解于 60、80、100 mL 水中获得 33.33%、25%、20%的盐水溶液；即盐水比例 1∶3、1∶4、1∶5）、炮制温度（130~160℃、180~200℃、200~240℃）、炮制时间（10 min、15 min、20 min、25 min）对盐小茴香中指标成分的影响（用盐量参照2015版《中华人民共和国药典》四部通则“0213炮制通则”，盐炙法中规定每100 kg待炮制品用食盐2 kg）。

3 结果与讨论

3.1 小茴香中SG、QG含量测定的方法学研究

3.1.1 供试品溶液制备方法的优选 系统考察了提取时间（20、30、40 min）、料液比（1∶25、1∶50、1∶100）、提取溶剂（25%甲醇、50%甲醇、75%甲醇、甲醇）对SG、QG提取效率的影响。每个提取条件平行制备两份样品（n=2），每份样品平行进样两次，以优选最佳的供试品溶液制备方法。结果表明，采用50%甲醇作为提取溶剂时，SG、QG的含量分别为1.194、1.233 mg/g，明显优于25%甲醇、75%甲醇、甲醇的提取效果；超声提取20 min时，SG、QG的含量分别为1.267、1.591 mg/g，明显优于超声处理10 min和30 min；提取溶剂的用量基本不影响小茴香中指标成分的提取效率，故最终选择25 mL。因此，确定供试品最优制备方法，如“2.3”项下供试品制备方法所述。

3.1.2 小茴香方法学验证研究 按“2.1”项下色谱条件测定“2.2”项下系列混合对照品溶液，平行进样2次，以对照品浓度为横坐标X（μg/mL），以对照品峰面积为纵坐标Y，绘制标准曲线；小茴香中SG、QG在相应浓度范围内线性关系良好（r＞0.999），检测限（S/N=3）分别为 0.002 7、0.003 4μg/mL；定量限（S/N=10）分别为 0.008 1、0.010 1 μg/mL；方法学验证结果均符合含量测定要求，结果如表1所示。

结果表明，SG、QG的日内精密度（相对标准偏差，RSD）分别为0.35%、0.23%，日间精密度RSD分别为1.34%、0.41%；小茴香供试品溶液在10℃条件下放置12 h内稳定性良好，RSD分别为0.45%、0.71%；加样回收率分别为98.65%、98.31%，RSD分别为1.42%、2.26%；该方法准确可行。

3.2 盐小茴香炮制工艺研究 系统考察了炮制过程中的盐水比例、炮制温度、炮制时间对小茴香中SG、QG含量的影响。采用“2.1”项下色谱条件测定供试品溶液中两种指标成分的含量，结果如图1所示。

结果表明，盐水比例对盐小茴香中SG、QG的含量基本没有影响；随着炮制温度的升高和炮制时间的延长黄酮类成分的含量逐渐下降，盐小茴香表面呈焦黑色。因此，结合生产的实际需要，最终确定盐小茴香的炮制工艺：取生小茴香至炒药锅（180~200℃）中，均匀翻炒，炒至微显火色，喷淋25%盐水溶液（每100 kg小茴香用食盐2 kg），继续炒至微干，炒制时间15~20 min，取出，放凉，即得。

图1 盐小茴香炮制工艺优选（n=2）Fig.1 Optimization of the processing technology of salt Fennel（n=2）

表1 SG、QG的线性回归方程、线性范围、相关系数、检测限、定量限、精密度、稳定性、加样回收率结果Tab.1 Linearity，LOD and LOQ，intra-and inter-day precision，stability，recovery of SG and QG

3.3 市售小茴香中指标成分的分析 为了研究市售小茴香指标成分含量的差异情况，本研究测定不同来源的16批小茴香（10批生小茴香、6批盐小茴香）。

结果表明，生小茴香中SG的含量为0.840~1.263 mg/g（RSD，13.87%）、QG 的含量为 1.161~2.418 mg/g（RSD，27.48%）；盐小茴香中 SG 的含量为 0.795~1.170 mg/g（RSD，12.61%）、QG 的含量为1.025~1.520 mg/g（RSD，14.20%）。盐小茴香中 SG、QG的含量略低于生小茴香，与本研究的结果基本一致。