基于酪蛋白酸钠/EGCG/阿拉伯胶自组装构建EGCG纳米粒及其形成机制研究

黄炜超,刘春花,罗旭洸,王淑惠,周爱梅,*

(1.华南农业大学食品学院,广东广州 510642; 2.广东省功能食品活性物重点实验室,广东广州 510642)

茶叶中富含的表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是一种极具开发前景的抗氧化、抗肿瘤功能活性物质,但其脂溶性较差,遇到高温或碱性条件,易发生氧化分解,且降解速度随着温度、pH、氧化浓度的增加而加快,限制了其在医药和食品等行业的应用[1]。构建活性物质运载体系可以有效的解决功能活性物口服利用度低这一瓶颈问题[2]。纳米乳液(Nanoemulsion)作为活性物质运载体系中的一种,是大小范围在10～1000 nm不等的胶体颗粒体系[3],其可以对药物增容和包裹,提高活性物质溶解度和稳定性,同时由于体积微小,可在血液循环系统中自由流动,因此较容易吸收和代谢,降低毒副作用[4]。在安全性上要求构建纳米粒的材料应为一般认为安全(Generally recognized as safe,GRAS)级别,同时要具有良好的生物相容性和生物可降解性。以往报道的一些纳米粒的构建涉及使用具有潜在毒性的溶剂或不可降解的材料,增加了口服利用的难度[5]。蛋白质和多糖是两类重要的食品大分子,它们通过相互作用形成的纳米粒具有良好的生物相容性和可降解性,同时具有更为突出的承载效果和靶向性[6]。因此利用蛋白质与多糖作为构建纳米体系的材料是近年来纳米领域的研究热点[7]。

酪蛋白酸钠(sodium caseinate,SC)具有亲水基团和疏水基团,因此具有良好的亲水性、乳化性、表面活性等,又因其具有良好的稳定性、成胶性和自组装特性,无毒副作用,高营养价值,可作为制备纳米载体的良好材料[8]。阿拉伯胶(gum arabic,GA)是一种安全无害的增稠剂,具有良好的亲水亲油性、水溶性和乳化稳定性,也是理想的载体材料[9]。目前未见到利用SC、GA自组装构建EGCG纳米粒的研究。因此,本研究基于SC、EGCG和GA三者自组装构建EGCG纳米粒,在前期研究SC与GA自组装构建空载SC-GA纳米粒的基础上,以EGCG和SC的浓度比、SC和GA总浓度为因素,以粒径及其分布、Zeta电位、包封率和载药量为指标,研究形成高载药量且稳定性好的SC-EGCG-GA纳米粒的条件,同时考察了纳米粒的微观形貌和贮藏稳定性,最后采用红外光谱、荧光光谱和圆二色谱对纳米粒结构进行表征,探讨纳米粒的形成机制。以期为EGCG新型功能性食品的研发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

酪蛋白酸钠(纯度98%)、阿拉伯胶(纯度97%) 美国Sigma公司;EGCG,纯度98%(HPLC) 日本TCI公司;甲醇(色谱纯) 美国 J.T.Baker公司;其他试剂 均为国产分析纯;Millipore Amicon Ultra-0.5超滤离心管 上海优宁维生物科技股份有限公司。

90 plus纳米粒度及Zeta电位仪 美国布鲁克海文仪器有限公司;LC-10ATVP plus高效液相色谱仪 日本岛津公司;VERTEX 70傅里叶变换红外光谱仪 德国Bruker公司;RF-5301PC荧光分光光度计 日本岛津制作所;JEM-2100F场发射电子显微镜 日本电子株式会社;Chirascan圆二色光谱仪 英国应用光物理公司。

1.2 实验方法

1.2.1 SC-EGCG-GA纳米粒的制备

1.2.1.1 SC-EGCG-GA纳米粒混悬液的制备 分别配制浓度为10 mg/mL的SC、GA和EGCG母液,在转速为400 r/min、25 ℃下搅拌的10 mmol/L NaCl体系中(pH6.0),按照相应比例加入一定体积的SC母液,之后逐滴加入相应比例的EGCG母液,避光搅拌30 min,随后逐滴加入相应比例的GA母液,用盐酸调节pH至4.2,避光搅拌2 h,得到SC-EGCG-GA纳米粒混悬液。

1.2.1.2 SC-EGCG-GA纳米粒制备条件研究 本研究在前期研究的基础上,固定SC和GA浓度比1∶1,pH4.2,NaCl浓度10 mmol/L,以EGCG和SC的浓度比(1∶10、1∶8、1∶6、1∶5、1∶4、3∶10、1∶3、2∶5和1∶2,固定SC和GA总浓度为1.5 mg/mL)和SC、GA总浓度(0.25、0.75、1.2、1.5、1.8、2 mg/mL,固定EGCG和SC的浓度比为2∶5)为因素,以粒径及其分布(多分散指数,polydispersity index,PDI)、表面带电量、包封率和载药量为指标,研究形成高载药量且稳定性好的SC-EGCG-GA纳米粒的条件。

1.2.2 包封率及载药量的测定 参照Hu等[10]的方法并稍作改进,采用超滤离心法测定EGCG的包封率和载药量。将0.5 mL SC-EGCG-GA纳米粒混悬液装入截留分子量为3000 Da 的超滤离心管中,4 ℃下12000 r/min 离心30 min,分别收集外管内离心后的液体和内管的纳米粒沉淀(冻干后称量即为纳米粒的总质量),通过HPLC检测超滤管中游离EGCG的含量。

HPLC检测条件:色谱柱:Eclipse Plus C18反相色谱柱(5 μm,4.6×250 mm,Agilent);检测器:岛津SPD-10A;检测波长:280 nm;柱温25 ℃;流速:1 mL/min;进样量:10 μL;流动相:A相为0.1%乙酸水溶液,B相为100%的甲醇溶液;梯度洗脱程序:30% B等度洗脱20 min。其中EGCG的包封率和载药量按照式1、2计算:

包封率(%)=(EGCG总投药量-游离EGCG量)/EGCG总投药量×100

式(1)

载药量(μg/mg)=(EGCG总投药量-游离EGCG量)/纳米粒总质量

式(2)

1.2.3 纳米粒贮藏稳定性研究 参照Li等[11]的方法并稍作修改,将制备的纳米粒混悬液充氮,添加4‰的叠氮钠作为防腐剂,于4 ℃下避光分别贮藏7、15、30 d后进行粒径、电位的表征,通过HPLC测定EGCG各个贮藏时间下纳米粒中EGCG含量,通过式3计算EGCG的保留率。

EGCG保留率(%)=贮藏指定时间时样品中被包埋的EGCG的含量/贮藏前样品中被包埋的EGCG的含量

式(3)

1.2.4 SC-EGCG-GA纳米粒的表征

1.2.4.1 粒径测定 取上述方法制备的SC-EGCG-GA纳米粒混悬液适量于样品池中,通过激光动态光散射法(DLS)测定纳米粒在水中的流体力学直径Dh(Particle size)和多分散指数(PDI)。

1.2.4.2 表面Zeta电位测定 将上述方法制备的SC-EGCG-GA纳米粒混悬液加入到样品池1/3高度处,赶走气泡,将钯电极插入溶液中,连上插头,关上仪器外盖,利用Zeta电位仪测定纳米粒的Zeta电位。

1.2.4.3 微观形貌分析 采用透射电子显微镜(transmission electron microscopy,TEM)观察SC-EGCG-GA纳米粒的表观形态及大小。参照Lu等[12]的方法稍作修改,将干净的铜网浸没于SC-EGCG-GA纳米粒混悬液中后取出,2 min后用滤纸吸去多余的纳米粒混悬液,用2%的磷钨酸染色3 min后吸取多余的染液,自然风干后进行电镜观察,测试加速电压为80 kV。

1.2.4.4 红外光谱分析 参考前人[13-14]的方法稍作修改,取少许EGCG、SC、GA,SC和GA为1∶1研磨混合的混合物,SC、GA和EGCG比例为5∶5∶2研磨混合的混合物,冻干的SC-GA纳米粒、冻干的SC-EGCG-GA纳米粒,分别按1∶100的比例与溴化钾混合研磨,经压片机压成透明的薄片,在4000～400 cm-1的范围以4 cm-1的分辨率扫描32次,采集样品图谱,环境温度为25 ℃。在与测试样品相同的条件下采集背景。

1.2.4.5 荧光发射光谱 参照前人[14-15]的方法稍作修改,固定SC浓度为0.5 mg/mL,按EGCG:SC(摩尔比)为0∶1、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、6∶1、12∶1、15∶1的比例分别制备SC-EGCG复合物、SC-EGCG-GA纳米粒复合物(GA浓度为0.5 mg/mL),分别在298和308 K的温度下进行测定。测定过程中固定激发波长λex=280 nm,激发狭缝和发射狭缝分别为5、3 nm。荧光扫描速度1200 nm/min,扫描范围分别300～500 nm。实验过程中用电子循环水浴控制样品温度。

1.2.4.6 同步荧光光谱 参照前人[14-15]的方法稍作修改,固定SC浓度为0.5 mg/mL,按EGCG∶SC(摩尔比)为0∶1、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、6∶1、12∶1、15∶1的比例分别制备SC-EGCG复合物、SC-EGCG-GA纳米粒复合物(GA浓度为0.5 mg/mL),在298 K温度下进行测定。当激发和发射波长差(Δλ)设为60 nm时,固定激发波长λex=265 nm,激发和发射狭缝均为2.5 nm,扫描范围为205～550 nm;当Δλ设为15 nm时,荧光激发和发射狭缝宽度分别为5、2.5 nm,测定体系在250～550 nm范围内的同步荧光光谱。实验过程中用电子循环水浴控制样品温度。

1.2.4.7 圆二色谱分析 参照Ayah[13]的方法稍作修改,固定SC浓度为0.125 mg/mL,按 EGCG:SC(摩尔比)为0∶1、1∶1、2∶1、4∶1的比例分别制备SC-EGCG复合物、SC-EGCG-GA纳米粒复合物(GA浓度为0.125 mg/mL)。以去离子水作为空白对照,测定190～260 nm波长范围内样品的圆二色谱,测定温度25 ℃,比色皿光径0.1 cm,步进1.0 nm,带宽1.0 nm,响应时间0.5 s。使用CDNN软件计算样品中蛋白质的二级结构(α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲)的含量。

1.3 数据处理

实验数据采用Origin 9.0软件作图,SPSS Statistics 17.0.1软件进行方差分析,所有实验均重复3次。

2 结果与分析

2.1 SC-EGCG-GA纳米粒的制备

2.1.1 EGCG和SC浓度比对SC-EGCG-GA纳米粒物理性质的影响 不同EGCG和SC浓度比对SC-EGCG-GA纳米粒物理性质的影响如表1所示。由表1可知,随着EGCG和SC浓度比的增大,纳米粒的粒径均逐渐增大直至浓度比达到1∶2时,体系产生沉淀,可能是因为SC是一种富含脯氨酸的蛋白质,与EGCG具有较强的亲和力[16],SC和GA浓度一定,随着EGCG浓度的增大,与SC结合的EGCG分子越多,形成的复合物粒径逐渐增大,但当EGCG浓度增加到一定范围,随着EGCG浓度的继续增大,EGCG作为多齿状配基,继续与复合物发生桥连形成二聚体或多聚体[17],所以体系出现沉淀。在体系未出现沉淀的比例范围内,各组的粒径均小于200 nm。

表1 EGCG和SC浓度比对SC-EGCG-GA纳米粒物理性质的影响Table 1 Effects of concentration ratio of EGCG to SC on the physical properties of SC-EGCG-GA nanoparticles

随着EGCG和SC浓度比的增大,Zeta电位的绝对值先减小后增大,主要原因在于SC与GA粒子表面的电荷与EGCG的表面电荷相反,当EGCG浓度较低时发生电中和,当EGCG浓度较高时EGCG表面的电荷得不到中和,体系显示和EGCG一样的电性且数值增大[18]。其中在EGCG和SC浓度比为2∶5时,Zeta绝对值达到最大(超过15 mV),与其他组具有显著性差异(p<0.05)。

各浓度比下PDI均小于0.2,表明体系纳米粒粒径分布均匀,在浓度比2∶5时达到最小,与其他组具有显著性差异(p<0.05)。EGCG包封率随着EGCG和SC浓度比的增大逐渐减小(p<0.05),载药量逐渐增大(p<0.05),这与Tang等[19]在研究聚谷氨酸与EGCG浓度比对聚谷氨酸-EGCG-壳聚糖纳米粒中EGCG包封率和载药量影响得到的结论一致。此外,在EGCG和SC浓度比为2∶5时,纳米粒载药量达到最大(338.49 μg/mg)。综合以上各个指标,为了得到载药量高、稳定性好的纳米粒,确定EGCG与SC的浓度比为2∶5。

2.1.2 SC和GA总浓度对SC-EGCG-GA纳米粒物理性质的影响 不同SC和GA总浓度对SC-EGCG-GA纳米粒物理性质的影响见表2。由表2可知,纳米粒的粒径随着SC和GA总浓度的增加而增大,当总浓度达到1.8 mg/mL时,体系即有沉淀产生,研究表明只有当体系中两种聚电解质(如研究中的SC和GA)总浓度小于某一浓度时,才可以形成纳米粒,在此浓度范围内,纳米粒的粒径随着总浓度的增加而增加,而当总浓度超过这一临界浓度时,体系会发生相分离而产生沉淀[20]。各浓度体系下的PDI均小于0.2,在总浓度1.5 mg/mL时达到最小,与其他各组间差异性显著(p<0.05)。此外,随着SC和GA总浓度的增加,Zeta电位的绝对值逐渐增大(p<0.05),在总浓度为1.5 mg/mL时达到最大(大于15 mV),这是因为在体系不发生相变产生沉淀的浓度范围内,随着SC和GA总浓度的增大,SC和GA各自的有效电荷密度增大,所以形成纳米粒的Zeta电位绝对值增大[21];纳米粒的包封率和载药量也逐渐增大,当 SC和GA浓度比一定,随着SC和GA总浓度的增大,SC浓度也相应增大,结合EGCG的能力增强,所以表现为包封率和载药量增大,且在SC和GA总浓度为1.5 mg/mL时达到最大。

表2 SC和GA总浓度对SC-EGCG-GA纳米粒物理性质的影响Table 2 Effects of concentration of SC and GA on the physical properties of SC-EGCG-GA nanoparticles

综上所述,要形成稳定的纳米粒,体系中SC和GA的总浓度不能太高(小于1.8 mg/mL),其中在总浓度为1.5 mg/mL时,纳米粒粒径小于200 nm,PDI小于0.2,Zeta电位绝对值大于15 mV,且包封率和载药量均达到最大。结合2.1.1结果,在SC和GA浓度比为1∶1、pH为4.2及NaCl浓度为10 mmol/L的条件下,选择EGCG与SC浓度比为2∶5、SC与GA总浓度为1.5 mg/mL制备纳米粒。

2.2 SC-EGCG-GA纳米粒微观形貌分析

在EGCG、SC和GA三者浓度比为2∶5∶5、SC和GA总浓度为1.5 mg/mL、pH4.2、NaCl浓度10 mmol/L的条件下制备SC-EGCG-GA纳米粒,通过TEM观测纳米粒在干态的形貌,如图1所示。TEM结果显示干态纳米粒子呈球形,分散均匀,粒径平均分布在180 nm左右,接近于激光粒度仪测得的平均粒径。

图1 SC-EGCG-GA纳米粒透射电镜图Fig.1 Transmission electron micrographs of SC-EGCG-GA nanoparticles

2.3 SC-EGCG-GA纳米粒贮藏稳定性研究

SC-EGCG-GA纳米粒贮藏稳定性结果如图2 所示。在贮藏15 d时粒径和电位无显著性差异(p>0.05),贮藏30 d时粒径增大(p<0.05),Zeta电位绝对值降低(p<0.05),EGCG保留率逐渐降低(p<0.05),但在30 d时保留率仍在80%以上,表明纳米粒对EGCG具有良好的保护作用。此外在30 d的贮藏时间段内,纳米粒处于稳定的范围,粒径均在200 nm以内,PDI均小于0.2,Zeta电位绝对值均大于15 mV,说明制备的SC-EGCG-GA纳米颗粒在溶液中具有很强的稳定性,EGCG渗出率小,纳米粒不易解离和聚集。

图2 贮藏时间对SC-EGCG-GA纳米粒物理性质的影响Fig.2 Effects of storage time on the physical properties of SC-EGCG-GA nanoparticles注:图中不同的字母表示不同贮藏 时间内具有显著性差异(p<0.05)。

2.4 SC-EGCG-GA纳米粒形成机制研究

2.4.1 红外光谱分析 为了表征EGCG、SC和GA相互作用前后表面基团的变化,以探讨SC-EGCG-GA纳米粒形成的机制,对EGCG、SC、GA、SC和GA两者的混合物、SC-GA纳米粒、三者的混合物和SC-EGCG-GA纳米粒的红外光谱进行考察(见图3)。EGCG的红外光谱(a)显示EGCG有很多特征吸收峰,如3556,3478,3356和3274 cm-1处酚-OH的伸缩振动,1691和1615 cm-1处没食子酸-C=O的伸缩振动,SC、EGCG、GA物理混合物(f)同时包含有SC、EGCG和GA的特征吸收峰,而SC-EGCG-GA纳米粒(g)中EGCG的特征吸收峰消失,表明EGCG可能被包裹在了纳米粒的内部,或者EGCG基团与SC和GA作用导致红外峰发生位移。此外,SC在2962和2872 cm-1处-CH3的反对称和对称伸缩振动可以用于研究SC-EGCG-GA纳米粒中疏水相互作用的存在与否[22]。由图中(g)可知,SC-EGCG-GA纳米粒在两处的吸收峰没有位移,说明在形成纳米粒时,疏水相互作用不是主要驱动力。

图3 不同样品的红外光谱图Fig.3 FTIR spectra of different samples注:a:EGCG,b:SC,c:GA,d:SC和GA混合物, e:SC-GA空载纳米粒,f:EGCG、SC和 GA混合物,g:SC-EGCG-GA纳米粒。

2.4.2 荧光光谱分析

2.4.2.1 荧光发射光谱 蛋白质是具有荧光特性的大分子,因色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等氨基酸残基具有苯环结构,是蛋白质内源荧光的主要来源。SC的荧光主要来自于色氨酸和酪氨酸,且荧光强度均在波长280 nm附近激发[23]。因此可以通过色氨酸和酪氨酸的SC自身荧光的猝灭研究EGCG与SC、GA之间的相互作用,从而探讨三者形成纳米粒的机制。图4a、4b和4c、4d分别显示了激发波长280 nm时,不同温度、不同浓度EGCG对SC-EGCG复合物和SC-EGCG-GA纳米粒复合物荧光发射光谱的影响。从图中可以看出发射波长在364 nm左右出现峰值,此时激发波长为280 nm;相同温度,SC中色氨酸和酪氨酸发射峰的荧光强度随EGCG浓度增加而降低,表明EGCG与SC的相互作用使SC内源荧光规律性猝灭;当EGCG浓度和温度都固定时,SC-EGCG-GA纳米粒复合物的荧光强度高于SC-EGCG复合物,说明GA的加入使EGCG对SC的荧光猝灭作用减弱,这可能是因为GA与EGCG竞争性的结合SC,在一定程度上抑制了SC与EGCG的结合所致[23]。Liang等[24]在研究花青素、溶菌酶和GA三者相互作用时也得到类似的结论。

图4 SC-EGCG复合物和SC-EGCG-GA纳米粒复合物荧光发射光谱Fig.4 Fluorescence emission spectra of SC-EGCG complexes and complexes of SC-EGCG-GA nanoparticles 注:a、b:298、308 K下SC-EGCG复合物;c、d:298、308 K下SC-EGCG-GA纳米粒复合物; 1～8:EGCG∶SC(摩尔比)为0∶1、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、6∶1、12∶1、15∶1。

根据 Stern-Volmer 方程可以判断荧光猝灭类型为动态猝灭或静态猝灭[25]。

式(4)

其中,F0表示加入猝灭剂时体系的荧光强度,F表示不加入猝灭剂时体系的荧光强度;[Q]为猝灭剂浓度(mol/L),Ksv为Stern-Volmer 猝灭常数(L/mol),Kq为双分子猝灭速率常数(L·mol-1·s-1),各类荧光猝灭剂对生物大分子的最大猝灭常数约为2.0×1010 L·mol-1·s-1,τ0为无猝灭剂时荧光大分子的平均寿命,一般约为10-8s。

根据Stern-Volmer方程,以[Q]为自变量,F0/F为因变量,通过线性拟合得到不同温度下SC-EGCG复合物和SC-EGCG-GA纳米粒复合物的Stern-Volmer曲线拟合方程、Ksv和Kq,结果见表3。由表3可知,Ksv随着温度的升高而减小,表明EGCG对SC的荧光猝灭为静态猝灭[26]。而不同温度下GA对SC的荧光猝灭速率常数Kq均大于猝灭剂对生物大分子的最大猝灭速率常数2×1010L·mol-1·s-1,进一步说明EGCG对SC的荧光猝灭为静态猝灭,这与其他小分子与SC相互作用的现象一致[27]。

表3 不同温度下SC-EGCG复合物和SC-EGCG-GA纳米粒复合物的Stern-Volmer方程常数和曲线拟合方程Table 3 Stern-Volmer quenching constants and curves fitted equation of SC-EGCG complexes and complexes of SC-EGCG-GA nanoparticles at different temperatures

根据以下双对数方程可以得到静态猝灭过程中分子之间的表观结合常数和结合位点数[28]:

式(5)

其中,F0表示加入GA时体系的荧光强度,F表示不加入GA时体系的荧光强度;[Q]为GA浓度(mol/L);Ka为表观结合常数;n为结合位点数;[Q]为猝灭剂的浓度(mol/L)。

表4 不同温度下SC-EGCG复合物和SC-EGCG-GA纳米粒复合物的表观结合常数和曲线拟合方程Table 4 Binding constants and curves fitted equation of SC-EGCG complexes and complexes of SC-EGCG-GA nanoparticles at different temperatures

可根据以下Lineweaver-Burk双倒数函数关系式求得小分子对SC静态猝灭结合常数[30-31]:

式(6)

ΔG=-RTlnK

式(7)

ln(K2/K1)=(1/T1-1/T2)ΔH/R

式(8)

ΔG=ΔH-TΔS

式(9)

多酚和蛋白质之间可能存在的相互作用力包括氢键、疏水相互作用、静电相互作用和范德华力等,利用相互作用的热力学参数可以推断EGCG与SC相互作用的机制。其中疏水相互作用使体系ΔH>0,ΔS>0;范德华力和氢键使体系ΔH<0,ΔS<0;静电相互作用使体系ΔH≈0,ΔS>0[32]。

经线性拟合得到不同温度下SC-EGCG复合物和SC-EGCG-GA纳米粒复合物的Lineweaver-Burk双倒数函数关系式,并计算得到热力学参数见表5。由表5可知ΔG<0,说明EGCG与SC的结合过程是自发的;ΔH<0,说明结合过程会释放热量,升高温度不利于EGCG和SC的结合;ΔH和ΔS都为负值,证明EGCG与SC之间结合的作用力包括氢键和范德华力。鉴于范德华力相比于氢键强度很弱,所以EGCG与SC结合的主要作用力为氢键。此外比较ΔH的绝对值可以得到,EGCG与SC结合的氢键数目较纳米粒多,说明在SC中加入GA可以抑制SC与EGCG结合发生聚集,提高体系的稳定性[27]。

表5 不同温度下SC-EGCG复合物和SC-EGCG-GA纳米粒复合物的 Lineweaver-Burk猝灭常数、曲线拟合方程和相关热力学参数Table 5 Lineweaver-Burk quenching constants,curves fitted equation and thermodynamic parameters of SC-EGCG complexes and complexes of SC-EGCG-GA nanoparticles at different temperatures

2.4.2.2 同步荧光光谱 具有荧光特性的氨基酸残基所处环境极性的改变可通过同步荧光光谱反映,氨基酸最大发射波长的变化可以用来推断蛋白质构象的变化。固定激发波长差Δλex=15 nm和Δλex=60 nm得到的同步荧光光谱分别代表酪氨酸和色氨酸残基的特征光谱。氨基酸最大发射波长若发生蓝移,表明蛋白质微环境的疏水性增强,肽链折叠的程度增加;若发生红移,表明蛋白质微环境的疏水性降低,肽链伸展的程度增加[33]。

图5a、5b、5c、5d分别显示了SC-EGCG复合物和SC-EGCG-GA纳米粒复合物酪氨酸和色氨酸的同步荧光光谱。从图中可以看出随着EGCG浓度的增加,SC-EGCG和SC-EGCG-GA纳米粒中酪氨酸和色氨酸残基的荧光强度均显著降低。此外,酪氨酸和色氨酸的最大发射波长均发生红移,说明EGCG与SC的结合使SC构象发生了改变,SC中的酪氨酸、色氨酸残基所处的微环境疏水性下降,亲水性增加,肽链更趋向于伸展状态,而且色氨酸的红移程度更大,证明SC的荧光主要源于色氨酸残基,EGCG与SC的结合位点更靠近于色氨酸残基[34]。

图5 SC-EGCG复合物和SC-EGCG-GA纳米粒复合物同步荧光光谱酪氨酸Fig.5 Synchronous fluorescence spectra of SC-EGCG complexes and complexes of SC-EGCG-GA nanoparticles注:a、b:Δλ=15 nm;c、d:Δλ=60 nm;1～8:EGCG∶SC(摩尔比)为0∶1、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、6∶1、12∶1、15∶1。

2.4.3 圆二色谱分析 EGCG浓度对SC-EGCG复合物和SC-EGCG-GA纳米粒复合物二级结构的影响见图6a、6b。根据图谱信息利用CDNN软件计算样品SC中各种二级结构(α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲)的含量,结果见表6。由图6可知SC有明显的负峰的波长范围为在200～235 nm,可以得到其二级结构中含其二级结构含α-螺旋和β-折叠,且随着EGCG浓度的增大,208 nm处的负峰值不断增大,说明α-螺旋含量降低;经过CDNN软件计算得到β-折叠、β-转角和无规则卷曲含量增加。以上变化表明EGCG与SC之间的相互作用会对SC的二级结构造成影响,EGCG与SC之间分子间氢键的形成使SC分子内部氢键含量减少,α-螺旋含量降低,从而导致SC中多肽链的构象更加趋向于折叠、伸展化[34]。此外,未加入EGCG时,SC与SC-GA纳米粒复合物相比,α-螺旋含量增加,无规则卷曲含量降低,这可能是因为GA与SC的静电斥力大于静电引力,同时存在于GA中的空间位阻可以起到稳定SC的作用,从而使SC处于有序状态[35]。由于GA的加入,使得SC-EGCG-GA纳米粒α-螺旋含量降低的程度低于单纯的SC,说明加入GA后,GA与SC的静电相互作用在一定程度上抑制了EGCG与SC的结合,有利于维持SC构象的稳定,这与荧光光谱得到的结论相一致。

表6 SC-EGCG复合物和SC-EGCG-GA纳米粒复合物各种二级结构的含量Table 6 The percentage of secondary structure of SC-EGCG complexes and complexes of SC-EGCG-GA nanoparticles

图6 SC-EGCG复合物及SC-EGCG-GA纳米粒复合物的圆二色谱Fig.6 CD spectra of SC-EGCG complexes and complexes of SC-EGCG-GA nanoparticles 注:a:SC-EGCG复合物;b:SC-EGCG-GA纳米粒复合物; 1～4:EGCG∶SC(摩尔比)为0∶1、1∶1、2∶1、4∶1。

2.4.4 SC-EGCG-GA纳米粒形成机制探讨 结合粒度表征、荧光光谱和圆二色谱结果得到GA的加入会在一定程度上抑制SC与EGCG聚集产生沉淀,针对多糖抑制蛋白质和多酚的形成聚集体目前存在着两种可能的机制:①多糖可以和蛋白质、多酚形成三者复合物,多糖可以提高复合物的水溶性,进而抑制蛋白质与多酚发生聚集;②多糖与蛋白质竞争性的结合多酚,通过对多酚进行包埋进而达到抑制其与蛋白质聚集的效果[36]。前期实验通过对GA与EGCG二元体系的浊度表征发现不管体系中两者的比例、总浓度如何变化,二者形成的混合体系浊度接近于零,体系状态都表现为澄清透明的状态,而浊度可以有效的表征两种物质复合凝聚的过程,它在一定程度上可以反应分散质的大小,浊度越大,说明体系中大分子颗粒物的数量越多[37],所以初步推断GA与EGCG之间的相互作用不明显或GA分子链中的氧原子与EGCG中的羟基可能发生结合形成氢键,但这个结合过程是可逆的[38]。综上,GA抑制SC和EGCG发生聚集的机制属于第一种。

3 结论

SC、EGCG和GA三者自组装形成稳定的SC-EGCG-GA纳米粒的条件为EGCG/SC/GA浓度比2∶5∶5、SC和GA总浓度1.5 mg/mL、pH4.2、NaCl浓度10 mmol/L,此时形成的纳米粒粒径约为173.52 nm,Zeta电位约为-19.94 mV,包封率约为62.82%,载药量达到338.49 μg/mg,于4 ℃贮藏30 d后稳定性好。TEM结果显示纳米粒呈球形,根据FTIR、荧光光谱和CD结果,推测纳米粒可能的形成机制为首先SC与EGCG通过氢键结合,GA加入后SC中的NH3和GA中的COO-通过静电相互作用结合,在一定程度上可以抑制SC与EGCG的过度结合与聚集,起到稳定三者复合物的作用,三者通过以上非共价作用自组装形成纳米粒。本研究首次通过SC、EGCG和GA三者自组装构建纳米粒并对纳米粒的形成机制进行研究,为蛋白质/多酚/多糖自组装构建纳米粒的理论体系提供有意义的补充。