鸡枞菌粗蛋白超声辅助提取工艺优化及其抗氧化活性

刘 静,李湘利,魏海香,赵 敏,薛丽萍,王雪萍

(济宁学院生命科学与工程系,济宁市特色农产品高值化加工工程技术研究中心,山东曲阜 273155)

鸡枞菌(Termitomycesalbuminosus)又称伞把菇、鸡脚麟菇,为担子菌纲口蘑科白蚁菌属[1],菌柄具有纤维结构、色泽似鸡肉,食之有鸡肉香味,故名鸡枞[2]。鸡枞菌主要分布于亚非等热带及南太平洋岛屿的亚热带地区,我国主产于福建、台湾和云贵川等地,是一种营养丰富、风味独特的食用菌[3],其子实体蛋白质含量极高,超过诸多食用菌蛋白质含量,且人体必需氨基酸占总量的15.15%[4]。鸡枞菌还有较高的医疗保健效果,可疗痔止血、健脾和胃,抵制癌细胞,降低血糖,抗衰老、增强机体免疫力等[5]。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鸡枞菌 购于金乡县联盛菌业科技有限公司,采后削根于37 ℃烘干至恒重后粉碎,过40目筛备用;考马斯亮蓝G250 国药集团化学试剂有限公司;牛血清白蛋白(BR) 上海伯奥生物科技有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) Sigma分装;2,2′-联氮基-双(3-乙基苯丙噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS) Amresco分装;焦性没食子酸、过硫酸钾 天津市大茂化学试剂厂;Tris(三氨基甲烷) 天津市博迪化工有限公司。

XH-300B型电脑微波超声波组合合成/萃取仪 北京祥鹄科技发展有限公司;723PC分光光度计 上海菁华科技仪器有限公司;FA2004N电子天平 上海精密科技仪器有限公司;FCD2000恒温鼓风干燥箱 上海琅玕实验设备有限公司;TDL-60B低速台式离心机 长沙英泰公司;PHS-3C pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司;LCJ-10冷冻干燥机 北京四环科学仪器长;FW135中草药粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 蛋白提取率的测定 采用考马斯亮蓝G250法测定蛋白质含量。分别吸取0.1 mg/mL牛血清白蛋白标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于试管中,补加蒸馏水至1.0 mL后,加入考马斯亮蓝G250试剂5.0 mL后摇匀静置3 min,于595 nm测定吸光度,以吸光度为纵坐标,牛血清白蛋白含量(mg/mL)为横坐标绘制标准曲线,所得回归方程为y=0.0018x+0.0246,R2=0.9916,线性范围0～300 μg/mL,计算鸡枞菌蛋白的提取总量(m1)。采用凯氏定氮法GB5009.5-2010测定鸡枞菌粗蛋白含量(m0),计算鸡枞菌蛋白提取率[21]。

式(1)

1.2.2 鸡枞菌粗蛋白提取工艺流程 鸡枞菌粉→超声波辅助碱法提取→离心(3000 r/min,15 min)→取上清液→测定蛋白提取率→酸沉(1 mol/L的HCl溶液调至pI 4.0)→离心(4000 r/min,15 min)→取沉淀→水洗(至pH7.0)→减压干燥(-80 ℃,1.4 MPa,24 h)→粗蛋白粉。

1.2.3 单因素实验设计

1.2.3.1 超声功率对鸡枞菌蛋白提取率的影响 在超声时间1.0 h,超声温度60 ℃,料液比1∶30 g/mL,用pH8的NaOH溶液提取,考察超声功率(300、400、500、600、700 W)对鸡枞菌蛋白提取率的影响。

1.2.3.2 超声温度对鸡枞菌蛋白提取率的影响 在超声时间1.0 h,超声功率500 W,料液比1∶30 g/mL,用pH8的NaOH溶液提取,考察超声温度(40、50、60、70、80 ℃)对鸡枞菌蛋白提取率的影响。

1.2.3.3 pH对鸡枞菌蛋白提取率的影响 在超声时间1.0 h,超声温度70 ℃,超声功率500 W,料液比1∶30 g/mL,用0.1 mol/L的NaOH调整提取液pH,考察pH(8、9、10、11、12)对鸡枞菌蛋白提取的影响。

1.2.3.4 料液比对鸡枞菌蛋白提取率的影响 在超声时间1.0 h,超声温度70 ℃,超声功率500 W,用pH11的NaOH溶液提取,考察料液比(1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40 g/mL对鸡枞菌蛋白提取率的影响。

1.2.3.5 超声时间对鸡枞菌蛋白提取率的影响 在超声温度70 ℃,超声功率500 W,用pH11的NaOH溶液提取,料液比1∶25 g/mL,考察超声时间(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h)对鸡枞菌蛋白提取率的影响。

1.2.4 正交实验 根据单因素实验结果,以蛋白提取率为指标,选取超声功率(A)、超声温度(B)、pH(C)、超声时间(D)四个因素设计L9(34)正交实验,实验因素与水平见表1。

表1 正交实验因素与水平表Table 1 Factors and levers of orthogonal experiment

1.2.5 超声波辅助与常规提取鸡枞菌粗蛋白的比较 参照文献[21]的方法,在料液比1∶25 g/mL、pH11、温度70 ℃下提取1.5 h,提取鸡枞菌粗蛋白,与正交实验最优实验结果对比,比较超声波辅助提取与常规方法的提取效果。

1.2.6 自由基清除能力的测定

1.2.6.1 ABTS+·自由基清除能力的测定 用2.45 mmol/L过硫酸钾配制备7 mmol/L ABTS+·储备液,避光静置12 h。用10 mmol/L磷酸缓冲液(pH7.4)稀释ABTS+·储备液,使其在734 nm吸光值为0.7±0.02;将鸡枞菌蛋白稀释成20、40、60、80、100、120 mg/L,吸取3 mL蛋白稀释液于试管中,加入12 mL ABTS+·测试液,摇匀后室温避光反应5 min,以95%乙醇为参比,于734 nm测吸光度(A1);同时测定以95%乙醇代替鸡枞菌蛋白提取液的吸光度(A0),以相同浓度梯度VC作对照,计算ABTS+·清除率[22]。

式(2)

1.2.6.2 DPPH·自由基清除能力的测定 将鸡枞菌蛋白稀释成10、20、30、40、50、60 mg/L,吸取鸡枞菌蛋白稀释液6 mL于试管中,加入6 mL 0.01 mmol/L DPPH·溶液,摇匀室温避光反应30 min,以无水乙醇为参比,于517 nm测定吸光度(A1);同时测定以6 mL无水乙醇代替鸡枞菌蛋白提取液的吸光度(A2),以6 mL无水乙醇代替DPPH的吸光度(A3);以相同浓度梯度VC作对照,计算DPPH·清除率[23]。

式(3)

式(4)

式中:ΔA0为邻苯三酚的自氧化法速率;ΔA为加入酶解液后邻苯三酚自氧化法速率(单位均为吸光度每分钟的增加值)。

1.3 数据处理

采用IBM SPSS Statistics 22.0软件对实验结果进行统计分析,应用Microsoft Excel 2003的FORECAST函数计算清除50%自由基所需鸡枞菌蛋白浓度(IC50)。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 超声功率对鸡枞菌蛋白提取率的影响 由图1可知,随超声功率升高,蛋白提取率呈先升高后降低的变化趋势;功率500 W时蛋白提取率最大,可达26.970%±0.666%,且与其他组差异显著(p<0.05)。由于超声功率的增加,超声波的机械效应和空穴效应增大,增加了对细胞壁的破碎作用,蛋白提取率增加;但功率过高也会导致泡沫产生,增加衍射衰减,不利于空穴现象的产生[25]。因此,超声波辅助提取鸡枞菌粗蛋白的功率在500 W左右。

图1 超声功率对鸡枞菌蛋白提取率的影响Fig.1 Effects of ultrasonic power on extraction rate of protein from Termitomyces albuminosus注:图中不同小写字母表示各组 数据差异显著(p<0.05),图2～图5同。

2.1.2 超声温度对鸡枞菌蛋白提取率的影响 由图2可知,随超声温度的升高,蛋白提取率呈先升高后降低的变化趋势;超声70 ℃时蛋白提取率最大,可达37.049%±0.631%,且与其他组差异显著(p<0.05)。因为温度升高可提高蛋白质溶解度,超声空化效应增强;当温度过高时,蛋白质会出现变性现象,空间构象被破坏,蛋白质疏水基团暴露,分子间相互结合而沉淀,溶解度下降[26]。所以,超声波辅助提取鸡枞菌粗蛋白的温度在70 ℃左右。

图2 超声温度对鸡枞菌蛋白提取率的影响Fig.2 Effects of ultrasonic temperature on extraction rate of protein from Termitomyces albuminosus

2.1.3 pH对鸡枞菌蛋白提取率的影响 由图3可知,随pH升高,蛋白提取率呈先升高后降低的变化趋势;pH11时蛋白提取率最大,可达52.305%±0.589%,且与其他组差异显著(p<0.05)。因为适当升高pH,蛋白质溶解度增大,但碱性太强时,蛋白质可能会出现变性和水解[21],增加了美拉德反应速度,加之蛋白质可能出现异味,发生颜色变化,外观质量下降[27],故超声波辅助提取鸡枞菌粗蛋白的pH在11左右。

图3 pH对鸡枞菌蛋白提取率的影响Fig.3 Effects of pH on extraction rate of protein from Termitomyces albuminosus

2.1.4 料液比对鸡枞菌蛋白提取率的影响 由图4可知,随料液比增大,蛋白提取率呈先升高后降低的变化趋势;料液比为1∶25 g/mL时蛋白提取率最大,可达52.271%±0.613%,且与其他组差异显著(p<0.05)。因为随料液比增大,体系黏度降低,提取率增加;但料液比过大时,物料过于分散,不利于蛋白质后期沉淀[28]。为此,超声辅助提取鸡枞菌粗蛋白的料液比在1∶25 g/mL左右。

图4 料液比对鸡枞菌蛋白提取率的影响Fig.4 Effects of liquid ratio on extraction rate of protein from Termitomyces albuminosus

2.1.5 超声时间对鸡枞菌蛋白提取率的影响 由图5可知,随超声时间的增加,蛋白提取率呈先升高后降低的变化趋势;超声时间为1.0 h时提取率最大,可达52.352%±0.720%,且与其他组差异显著(p<0.05),而后逐渐降低。因为适宜的超声时间可使细胞破裂促进蛋白质的提取,但时间过长会引起蛋白质的变性甚至降解,故蛋白质提取率呈下降趋势[29]。因此,超声辅助提取鸡枞菌粗蛋白的提取时间在1.0 h左右。

图5 超声时间对鸡枞菌蛋白提取率的影响Fig.5 Effects of time on extraction rate of protein from Termitomyces albuminosus

2.2 正交实验结果

为优化超声波辅助提取效果，在单因素实验基础上,固定料液比1∶25 g/mL,以超声功率(A)、超声温度(B)、pH(C)、超声时间(D)4个因素进行L9(34)正交实验优化鸡枞菌粗蛋白提取参数,实验结果见表2,方差分析见表3。

表2 超声波辅助提取鸡枞菌粗蛋白正交实验设计及结果Table 2 Orthogonal array design and results of protein extraction of Termitomyces albuminosus with ultrasonic assisted

表3 超声波辅助提取鸡枞菌粗蛋白正交实验优化工艺方差分析Table 3 Orthogonal test analysis of variance on extraction of protein from Termitomyces albuminosus with ultrasonic assisted

由表2可知,各实验因素对鸡枞菌蛋白提取率的影响程度为B>A>C>D,即超声温度>超声功率>pH>超声时间。超声波辅助提取鸡枞菌粗蛋白的最优化条件为A1B3C3D3,即超声功率为400 W,超声温度为70 ℃,pH为11,超声时间为1.5 h。

由表3可知,超声功率、超声温度、pH、超声时间均对粗蛋白提取有极显著影响(p<0.01)。在正交实验所得最适提取条件超声功率400 W,超声温度70 ℃,pH11,超声时间1.5 h的条件下,进行超声波辅助提取鸡枞菌粗蛋白的验证实验,所得鸡枞菌蛋白质含量为86.525%±1.315%,蛋白提取率为67.322%±1.028%。无超声处理的常规法,在相同条件下提取鸡枞菌蛋白含量为74.067%±1.238%,蛋白提取率为42.238%±0.876%;400 W超声波辅助鸡枞菌蛋白提取率比常规法提高了59.387%,蛋白质含量提高了16.820%,这说明超声波促进了鸡枞菌粗蛋白的溶解和扩散,使蛋白提取率显著提升(p<0.05)。

2.3 鸡枞菌粗蛋白的抗氧化活性分析

2.3.1 对ABTS+·的清除能力分析 由图6可知,鸡枞菌粗蛋白对ABTS+·有一定的清除能力,随粗蛋白浓度增加,对ABTS+·的清除能力逐渐增加,粗蛋白浓度为120 mg/L时,ABTS+·清除率最大可达92.485%±0.515%(p<0.05),粗蛋白和VC清除ABTS+·的IC50分别为46.322、10.431 mg/L,但粗蛋白的清除效果低于同浓度VC的清除效果(p<0.05)。

图6 鸡枞菌蛋白对ABTS+·的清除能力Fig.6 ABTS+· radical scavenging activity of protein from Termitomyces albuminsous注:图中不同小写字母表示同一质量浓度不同清除率间 差异显著(p<0.05),图7、图8同。

2.3.2 对DPPH·的清除能力分析 由图7可知,鸡枞菌粗蛋白对DPPH·有一定的清除能力,且随粗蛋白浓度增加,对DPPH·的清除能力逐渐增加,粗蛋白浓度为60 mg/L时,DPPH·最大清除率可达47.165%±3.185%,粗蛋白和VC清除DPPH·的IC50分别为61.176、3.890 mg/L,粗蛋白清除效果显著低于同浓度VC的清除效果(p<0.05)。

图7 鸡枞菌蛋白对DPPH·自由基清除能力Fig.7 DPPH· radical scavenging activity of protein from Termitomyces albuminsous

图8 鸡枞菌蛋白的对自由基的清除能力 radical scavenging activity of protein from Termitomyces albuminsous

3 结论