基于对迈克尔受体加成反应的硫醇荧光探针的设计合成及其性质研究

王利刚，解 海，韩生华，陈泽忠，冯 锋

（山西大同大学化学与环境工程学院，山西大同037009)

硫醇在生物系统中扮演着关键的角色，其中包含有3个含巯基的生物分子，它们是半胱氨酸(Cys)，同型半胱氨酸(Hcy)及谷胱甘肽(GSH)，三者有着相似的结构。通常，细胞内硫醇的含量与许多疾病有着很紧密的联系，比如白血病、肾病、肝病和艾滋病等[1-3]。另一方面，不是所有的硫醇都对生物体起着至关重要的作用，其中苯硫醇不仅是一种污染物而且也是一类剧毒物质。一般来说，它比脂肪族类醇更有毒，可以引起一些疾病如咳嗽、气促，头疼等。因此检测生物体中的这些含巯基的生物分子显得非常重要。而在众多的检测方法中荧光是最重要的，这是由于其具有操作简单性以及较低的检测限，此外荧光探针技术最重要的优势就是荧光探针可以在细胞内进行检测[4-6]。大多数已报道的生物硫醇探针利用了硫醇的强亲核性和对金属离子的强亲和力[7-11]。硝基烯烃作为一个良好的迈克受体，被广泛的应用到有机合成中，我们希望通过迈克加成反应从而达到对硫醇的专一识别，为此我们设计合成了包含有迈克尔受体的主体化合物1，其分子式如图1所示。

图1 主体化合物1

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

Bruker ARx300型超导核磁共振仪（布鲁克科技有限公司），Agilent 845型紫外可见光谱仪（安捷伦科技有限公司），HITACHI F-2500 型荧光光谱仪（日应公司），UETTLER TOLEDO FE20 型pH 计（梅斯勒-托利多国际贸易有限公司）。

浓硫酸、氢氧化钠、无水硫酸钠、氯化钠（北京化工厂）、间苯二酚、乙酰乙酸乙酯、吡啶、六亚甲基四胺、三氟乙酸、硝基甲烷、哌啶（阿拉丁试剂公司）、乙醇、二氯甲烷，乙酸乙酯、石油醚（天津恒光化学试剂公司），醋酸酐（天津试剂二厂）。以上试剂均为分析纯。实验所用的氨基酸均配制成浓度为10-1mol/L的溶液，使用时按需稀释。

1.2 目标化合物的合成

主体化合物的合成步骤如图2。

图2 合成路线

1.2.1 中间体2的制备

在500 mL的三口烧瓶中，加入200 mL浓硫酸，烧瓶用冰浴冷却，当温度下降到10 ℃以下时，滴加22 g(0.2 mol)间苯二酚和26 g新蒸的乙酰乙酸乙酯配成的溶液并不断的搅拌混合物，同时用冰盐浴将温度维持到10 ℃以下约2 h，全部溶液滴加完后将反应混合物冷却的放置24 h后，将反应混合物倾入40 g 碎冰和600 mL 水的混合物中并激烈搅拌，析出沉淀后抽滤，用50 mL冰水洗涤3次，得到粗产品。

将粗产品溶于300 mL 5%氢氧化钠溶液中，过滤后向滤液中加入110 mL 稀硫酸并不断搅拌至酸性，此时目标产物结晶析出后抽滤，再用冷水产物，干燥后用95%的乙醇重结晶，得到无色的针状晶体化合物27 g，产率为76.3%。

1.2.2 中间体3的制备

在250 mL 圆底烧瓶中分别加入100 mL 二氯甲烷，5.28 g(30 mmol)中间体 2，4 mL 醋酸酐，滴入催化量的吡啶2 滴，在室温下搅拌过夜，旋干溶剂，得到粗产品，将粗产品溶于水中并用乙酸乙酯萃取，然后将乙酸乙酯层用饱和食盐水洗涤，然后向有机层中加入无水硫酸钠干燥，旋干经过柱色谱分离（乙酸乙酯∶石油醚=1∶2）得到白色固体化合物为5.5 g产率为85.9%。

1.2.3 中间体4的制备

在100 mL圆底烧瓶中分别加入40 mLTFA(三氟乙酸)，4.08 g (20 mmol)中间体 3 和 4.08 g (29 mmol)六亚甲基四胺，搅拌反应，待溶液恢复到室温，加热回流8 h，旋干TFA，剩余的溶液中加入60 mL水，加热到60 ℃，将水旋干为粘稠状物体，用甲醇溶解并用柱色谱分离(三氯甲烷∶甲醇=50∶1)得到中间体4。mp=140 ～ 142。C，1H NMR(300 MHz，CDCl3)∶δ12.24 (s，1H)，10.64 (s，1H)，7.76 ～ 7.73 (d，1H)，6.94 ～ 6.91(d，1H)，6.23(s，1H)，2.45(s，3H)。

1.2.4 主体化合物1的制备

在100 mL 圆底烧瓶中分别加入50 mL 乙醇，0.3 g(1.5 mmol)中间体4，0.1 g(1.8 mmol)硝基甲烷，0.1 g (1.8 mmol) 哌啶，加热回流9 h，反应溶液变为为砖红色，旋干，经柱色谱分离(三氯甲烷∶甲醇= 50∶1)过去前面的杂质点，再经柱色谱分离(三氯甲烷∶甲醇= 5∶1)得到红色产品。1H NMR(600 MHz，DMSO)∶δ 8.422 ～ 8.399(d，1H)，8.244 ～8.222 (d，1H)，7.781 ～ 7.766 (d，1H)，6.982 ～ 6.968(d，1H)，2.387 (s，3H).13N NMR (150MHz，DMSO)∶159.63，154.40，154.33，132.05，130.51，129.13，128.63，113.37，112.44，110.88，105.38，18.81。

2 主体化合物1对硫醇的识别研究

2.1 溶液的配制

精确称取4.94 mg主体化合物1，用乙腈定容到10 mL 的容量瓶中，得到浓度为2 mmol/L 的Stocks溶液。将Stocks 溶液用HEPES(0.1 M，pH=7.0)缓冲溶液稀释到40 mmol/L，作为待测溶液。准确称量各种氨基酸，用去离子水定容到10 mL的容量瓶中，得到客体溶液的浓度为10 mmol/L。

2.2 主体化合物1对生物硫醇的识别研究

图3为在HEPES(0.1 mol/L，pH=7.0)缓冲溶液中，主体化合物1(40 mmol/L)与各种氨基酸作用后的紫外吸收光谱变化图，加入氨基酸的量为40 N。从图3 中可以看出主体化合物1 本身在455 nm 和360 nm 处有明显的吸收峰。加 Ala、Asp、Glu、Hls、Lys、Pro、Ser 后2处的吸收峰强度基本没有变化，只有加入Cys 时，2 处的吸收峰才明显下降，并且在455 nm 处的吸收峰基本降平。由于其他氨基酸的加入基本没有引起紫外吸收光谱的变化，这充分说明了化合物1 可以对Cys 进行高选择性的识别。

图3 在HEPES(0.1 M，pH = 7.0)缓冲体系中干扰氨基酸存在下化合物1识别Cys的选择性紫外吸收光谱图

由于Cys、Hcy以及GSH结构相似，都包含有相同的巯基。因此我们进一步研究了化合物1对Hcy以及GSH 的响应情况。图4 为主体化合物1 在HEPES(0.1 M，pH = 7.0)缓冲溶液中对Cys、Hcy 以及GSH 的紫外吸收光谱变化图，加入的化合物1的浓度为 40 mmol/L，Cys、Hcy 以及 GSH 的量为40 N。从图中可以看出主体化合物1 在455 nm 和360 nm有吸收峰，分别加入Cys、Hcy以及GSH后，三者都引起了两处吸收峰的下降，说明化合物1对Cys、Hcy以及GSH都具有识别作用。

图4 化合物1与Cys，Hcy，GSH的吸收光谱

此外我们还利用紫外可见吸收光谱研究了主体化合物1 在HEPES(0.1 M，pH=7.0)缓冲溶液中，与Cys、Hcy以及GSH的响应时间。从图5中可以直观的看出，主体化合物1与Cys、Hcy以及GSH作用时间非常快，10 s即可反应完全。作为一个优良的探针，响应时间短也是其一大优点。

图5 主体化合物1与Cys、Hcy、GSH作用后的吸收强度随时间变化的柱状图

图6 为主体化合物1 在HEPES(0.1 mol/ L，pH=7.0)缓冲溶液中，与各种氨基酸作用后的荧光光谱变化图。化合物1 本身在455 nm 处有微弱的发射峰，加入Ala、Asp、Glu、Hls、Lys、Pro、Ser 后荧光强度基本没发生变化。只有加入Cys、Hcy 以及GSH后才引起了荧光光谱的明显变化，荧光增强的强度Hcy＞Cys＞GSH。说明化合物1可以选择性的识别Cys，Hcy以及GSH。

图6 化合物1与各种氨基酸作用后的发射光谱图

当Hcy 与其他氨基酸共存时，化合物1 仍然可以对Hcy高选择性的识别。其他氨基酸的存在几乎对识别过程不产生任何干扰(图7)。

图7 在HEPES(0.1 M，pH = 7.0)缓冲溶液中主体化合物1与各种氨基酸反应的荧光响应的柱状图

3 结论

本实验设计合成了包含有硝基烯基团的香豆素衍生物化合物1，利用硫醇对迈克受体的加成反应引起了化合物1 荧光性质的改变从而达到识别生物硫醇的目的。通过1H NMR、13C NMR 等手段的表征，并充分利用紫外可见光谱以及荧光光谱等分析手段分别对化合物1 可以识别生物硫醇的行为进行了研究。在HEPES 缓冲溶液中，其他氨基酸的存在几乎不会对化合物1 高选择性的识别生物硫醇的过程造成任何干扰；并且化合物1在识别生物硫醇过程中可以通过肉眼直接观测到溶液的颜色由黄色变为无色的，这一特点使得探针1 可以在不借助仪器分析的条件下快速的判断出生物硫醇的存在，达到实际应用的要求。