杜鹃红山茶的组织培养技术研究初探

韩 伟,马丽霞

（韶关学院 英东生命科学学院，广东 韶关512005）

杜鹃红山茶（Camellia changii）是山茶科山茶属植物，与山茶、油茶、茶等植物同科同属.杜鹃红山茶花似山茶叶像杜鹃，花大而鲜艳，一年四季都能开花，俗称“四季茶”，与普通的山茶相比具有极高的观赏价值.杜鹃红山茶是山茶科中的一个极其珍稀的品种，其自然种群分部狭窄，目前仅见于广东省阳春县河尾山，结实率和种子萌发率都很低，一度曾濒临灭绝，有“植物界大熊猫”之称，该种已被《中国物种红色名录》列为极危种［1］.因此，为了更好的保护这一珍贵的植物资源，对杜鹃红山茶快速繁殖技术的研究迫在眉睫.

杜鹃红山茶繁殖的研究目前主要集中在传统的人工扦插［2-4］和嫁接繁殖［5-7］方面，而利用植物组织培养技术对其进行繁殖的研究报道较少［8-12］.如将杜鹃红山茶的幼嫩的茎段在无菌条件下进行繁殖，预期获得大量种苗，为生产花卉的企业提供大量的苗木，进而为地方经济建设服务.同时也为探索木本花卉快速繁殖提供借鉴.但是杜鹃红山茶属于山茶科植物，该科植物体中通常含有大量的酚类化合物，木质素、单宁或色素，所以在组织培养过程中极易导致外植体发生裼变，部分细胞也会因褐变物质的毒害而死亡，且内外生菌的污染对诱导分化产生了一定的影响.笔者利用植物组培技术对杜鹃红山茶的繁殖进行了探讨，主要从不同激素配比对杜鹃红山茶叶片和茎段愈伤组织的影响进行探讨，又关注了外植体污染和褐化的问题，旨在为其组织培养技术提供参考.

1 材料和方法

1.1 材料 于天气晴朗的上午8:00～10:00时剪取杜鹃红山茶（用于植株嫁接，见图1-A）上的幼嫩的叶片和带侧芽的茎段（刚抽出不久，半木质化）.

1.2 培养条件 以MS为基本培养基，按表1激素配比配制培养基（琼脂7.5 g/L，蔗糖30 g/L，pH 5.8，121℃高压灭菌 20 min）.培养温度 26±1℃，湿度 70%～80%，光照时间 16 h/d，光照强度 1 500～2 000 lx，20 d 继代 1 次.

1.3 外植体的预处理 从杜鹃红山茶母株上剪取较嫩的叶片，侧芽和顶芽饱满的新梢后，用流水反复冲洗1 h，洗去表面污物后用洗衣粉仔细清洗，再用清水冲洗、半凉干，放置在烧杯中用1.4 g/L抗坏血酸浸泡1 h.

图1 杜鹃红山茶的组织培养

1.4 外植体接种

将取材多余的部分进行裁剪，待接种的外植体在75%的酒精中表面消毒30 s，双蒸水冲洗3～5次；再置于0.1%的氯化汞中消毒9 min，双蒸水洗涤4～6次；消毒好的外植体置于滤纸上晾干表面水分并准备接种.将叶片切成约0.7～1 cm的小块，将带侧芽的茎段切成1.0～1.5 cm的小段，每段留1～2个芽，分别接种培养基上（见表1），每种培养基分别接叶片、茎段各30瓶，每瓶接种2～3个外植体，观察愈伤组织诱导情况，统计诱导率.另外，将杜鹃红山茶带侧芽的茎段作为外植体接于MS+6-BA 1 mg/L+IBA 0.01 mg/L+GA3 10 mg/L［8］或MS+6-BA 1 mg/L+IBA 0.01 mg/L的培养基上培养30 d后，观察侧芽的萌发情况，统计萌发率.

表1 诱导愈伤组织的不同激素配比/（mg/L）

2 结果和分析

2.1 培养基中的激素配比对杜鹃红山茶叶片和茎段愈伤组织诱导的影响

将杜鹃红山茶的叶片、茎段接种于表1中的培养基上后，叶片和茎段都能诱导出愈伤组织.观察发现在叶片和茎段分别培养13，15 d出现愈伤组织.培养30 d后，叶片在不同激素组合中愈伤组织的状态有较大差别：在含有NAA的培养基上，愈伤组织颜色发黄，较致密（见图1-B）；而在含有IBA的培养基上的愈伤组织颜色为白色或淡绿色，较为疏松（见图1-C）.茎段诱导出的愈伤组织致密并带红色（见图1-D）.与其它激素配比相比，叶片和茎段在6-BA/IBA或者6-BA/NAA配比为1∶1时，愈伤组织诱导率较高，当6-BA浓度一定时、IBA或NAA浓度相对低时，茎段愈伤组织的诱导率相对较高（见表 2）.叶片在MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L培养基上愈伤组织的诱导率达到最高，为52.3%，茎段在MS+6-BA 1.0 mg/L+IBA 1.0 mg/L培养基上愈伤组织的诱导率达到最高，为56.8%.

表2 不同激素配比对杜鹃红山茶叶片和茎段愈伤组织诱导的影响

2.2 培养基中的激素配比对杜鹃红山茶带侧芽的茎段上芽萌发的影响

当把杜鹃红山茶带侧芽的茎段接种到两种不同的培养基上（见表3），培养15 d后，可观察到茎段上的侧芽和顶芽有萌动的现象，芽周围的叶柄脱落，芽苞开始膨大（见图1-E）.培养30 d后可以看到叶片长出（见图1-F）.茎段的基部没有看到愈伤组织产生.培养基中添加GA3后，芽的萌发率可达到57.1%，没有添加GA3的培养基芽的萌发率只达到46.4%，说明培养基中添加GA3有利于杜鹃红山茶茎段上芽的萌发.

表3 不同的激素配比对杜鹃红山茶带侧芽的茎段上芽萌发的影响

3 讨论

3.1 培养基中的激素配比对诱导愈伤组织的影响

植物愈伤组织的诱导中，激素的浓度和种类起着重要作用.山茶科植物常用的诱导愈伤组织的激素有2,4-D、6-BA、NAA和IBA［13-16］.实验研究究发现培养基中细胞分裂素/生长素配比为1∶1时较适宜诱导杜鹃红山茶的愈伤组织，但石兰蓉［12］研究结果表明MS+2,4-D 2.0 mg/L+6-BA 0.5 mg/L是杜鹃红山茶愈伤诱导的最佳培养基，其细胞分裂素/生长素配比为1:4，与本文结果有不同之处，可能是由外植体生理年龄及生长状态不同导致的.培养基MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L适宜诱导叶片的愈伤组织的产生，诱导率最高为52.3%，NAA在叶片的愈伤组织诱导中的效果优于IBA；培养基MS+6-BA 1.0 mg/L+IBA 1.0 mg/L中茎段的愈伤组织诱导率最高为56.8%，而IBA在茎段的愈伤组织诱导中的效果优于NAA.可见，不同的外植体在愈伤组织诱导时所需的激素种类及浓度均不同.

杜鹃红山茶茎段在MS+BA 1 mg/L+IBA 0.01 mg/L+GA3 10 mg/L的培养基上培养30 d，芽萌发率可高达57.1%，与没有添加GA3的培养基相比，芽的萌发率较高，说明GA3在杜鹃红山茶茎段上芽的萌发时起着重要的作用，有利于芽的萌发，提高芽的萌发率.另外，GA3通常在植物组织培养中用作促进芽伸长的一种激素［17］.因此，考虑在木本植物的组织培养中添加一定量的GA3，可促进芽的萌发和伸长，加快芽的生长速度.本文所得到杜鹃红山茶茎段上的芽萌发率57.1%低于蔡静如等［8］研究的结果(芽的萌发率可达到68%)，原因可能是采取的外植体生理年龄不同，本文采取的是嫁接植株上的杜鹃红山茶茎段，而前人采用的是实生苗上的茎段.

3.2 污染探讨

有效控制微生物污染是植物组织培养成功的关键技术之一.山茶科植物组织培养中污染的原因主要由外植体、培养基和无菌操作3个方面引起的，其中以外植体方面的污染最复杂，也最难控制.外植体的污染主要由表面消毒不彻底和内生菌造成的，通常接种之后的一周就会表现出来.试验中发现杜鹃红山茶的组织培养中外植体的污染主要由内生菌造成的.本文通过外植体接种前的预处理，取材时选用刚抽生的新梢及缩短继代的时间，有效的降低了外植体内生菌的污染率.

3.3 外植体褐化

外植体褐化主要是因为茶组织分泌的多酚类物质被氧化所致.由于山茶科植物组织中酚类物质含量较高，当酚类化合物含量高时，木质素、单宁或色素形成就多，易导致褐变的发生，有些细胞会因褐变而死亡［18］.杜鹃红山茶叶片和茎段在培养过程中都有褐化的现象，切口褐化对愈伤组织生长会产生不利影响.若是局部褐化，对愈伤组织的诱导影响较小，全部褐化会导致外植体快速死亡，阻碍愈伤组织的诱导.与叶片、腋芽、顶芽比较，茎段的褐化现象较轻.同时发现添加吸附剂(如活性碳)和添加抗氧化剂（如PVP）的培养基，或是外植体经过Vc浸泡处理的，外植体褐化现象较轻，褐变得到一定控制；没有处理的培养基褐化较严重.