他莫昔芬治疗转染孕激素受体膜组分1乳腺癌裸鼠模型对乳腺肿瘤组织Ki-67表达的影响

张凌燕 阮祥燕* 蔡桂举 谷牧青 Alfred O．Mueck,2

(1.首都医科大学附属北京妇产医院内分泌科，北京 100026；2.德国图宾根大学妇产医院妇女健康部与妇女健康研究中心，图宾根 D-72076，德国)

乳腺癌是世界范围内女性发病率最高的恶性肿瘤，是女性死亡的主要原因[1]。乳腺癌的发病原因与雌激素受体(estrogen receptor，ER)的作用密切相关，孕激素受体膜组分1(progesterone receptor membrane component 1，PGRMC1)与雌激素受体α(estrogen receptor α，ERα)之间在乳腺癌细胞增生过程中可能存在一定的交互作用[2]，即ERα可能在雌激素或雌孕激素作用下由PGRMC1介导的信号通路中发挥重要作用。他莫昔芬(tamoxifen，TAM)等内分泌治疗在激素受体(hormone receptor，HR)阳性乳腺癌的术后辅助治疗、晚期乳腺癌的一线治疗中均发挥着重要的作用。目前，常用的内分泌治疗药物包括抗雌激素药物、芳香化酶抑制剂、促黄体生成素释放激素类似物和孕酮制剂等。TAM是最常用的非甾体类抗雌激素药物，于20世纪70年代开始应用于乳腺癌患者的治疗。目前关于PGRMC1和TAM之间的相互作用尚未报道，本文就TAM对转染PGRMC1乳腺癌裸鼠模型MCF-7乳腺肿瘤Ki-67的表达影响进行探讨。

1 材料与方法

1.1 细胞

乳腺癌MCF-7细胞系购自美国标准培养库。

1.2 细胞培养

将MCF-7乳腺癌细胞系培养于含10%(体积分数)热灭活胎牛血清、25 mmol/L HEPES以及1%(质量分数)青霉素的RPMI-1640培养液中。在37 ℃ 5%(体积分数)CO2(细胞培养箱中)进行孵育，待细胞融合率达90%时进行传代培养。

1.3 细胞转染

MCF-7细胞转染HA标记的PGRMC1(MCF-7-HA-PGRMC1)或空质粒(MCF-7-HA-vector)，48 h后，用G418进行为期3周的单克隆筛选。使用PCR技术将转染的PGRMC1 cDNA与内源性PGRMC1进行区分。为避免转染试剂的影响，将MCF-7-HA-vector设置为对照组。最后，Western blotting法检测MCF-7-HA-PGRMC1及MCF-7-HA-vector的PGRMC1表达情况。

1.4 动物分组及实验方法

本研究为排除裸鼠本身雌激素分泌对实验结果的影响，无菌环境下全身麻醉(以下简称全麻)后，行去势手术，并在裸鼠颈部皮下包埋17β-雌激素(estradiol, E2)缓释片。包埋雌激素缓释片48 h后，将上述小鼠按体质量数字表法随机分为两组，进行后期的PGRMC1转染等处理。本课题主要研究乳腺癌，基础水平的E2为裸鼠体内作为异种移植物的激素反应细胞生长所必需。

1.4.1 Ki-67在MCF-7/PGRMC1鼠中的表达

上述BALB/c雌性裸鼠48只，无菌环境下全麻后，行去势手术后采用数字表法随机分为两组，每组24只，实验组(MCF-7/PGRMC1组)于裸鼠的左右侧面皮下注射等量的1×107个MCF-7-HA-/PGRMC1细胞，对照组(MCF-7/vectorr组)于裸鼠的左右侧面皮下注射等量的1×107个MCF-7-HA-vector细胞。

1.4.2 他莫昔芬对MCF-7/PGRMC1鼠Ki-67表达的影响

至种瘤的第43天，按肿瘤体积大小分别再将两组裸鼠各自采用数字表法随机分为4个亚组，每组6只。各亚组裸鼠分别加用玉米油、黄体酮、他莫昔芬、他莫昔芬联合黄体酮处理。其中，黄体酮为缓释片(10 mg/60 d)，他莫昔芬100 μL腹腔注射剂(5 mg/mL)(3 d给药+1 d停药，共4周)。种瘤56 d后实施安乐死，无菌操作下完整摘除肿瘤组织，免疫组织化学法(immunohistochemistry, IHC)检测荷瘤体中Ki-67表达情况。

1.5 IHC测定Ki-67蛋白水平

将裸鼠移植瘤切成3 μm厚度后进行IHC检测Ki-67的表达情况。常规石蜡切片，恒温箱烘烤，脱蜡水化，水化按说明书进行操作。组织切片在干燥箱(上海慧泰仪器制造有限公司，型号DHG-9140A)中脱蜡加热至少12 h，600 ℃，以揭示抗原位点。切片在自动模式下使用Ventana基准GX染色(美国Ventana Medical Systems公司)用于Ki-67的评估。Ki-67兔抗人单克隆抗体(GB13030-2，武汉Servicebio公司)；IHC二抗检测试剂盒(编号GB23204，武汉Servicebio公司)，DAB缓冲液及DAB原液(编号G1211，武汉Servicebio公司)。试验过程按照试剂盒说明进行，苏木素衬染。

1.6 免疫染色的评估

IHC结果判读：苏木素染细胞核为蓝色，DAB显出的阳性表达为棕黄色。

应用半定量分析方法对肿瘤组织中的Ki-67进行评分，评分依据为染色强度(弱、中、强)和核免疫染色阳性细胞所占百分比(范围：0～100%)。对随机选择的3个乳腺组织切片进行计数放大到400倍。当染色均匀时，计数两个边缘区域和一个中心区域来进行肿瘤异质性的分级。评分范围在0 ～ 100%之间，阳性分界值为14%。由两名病理学家分别对Ki-67的IHC评分进行评估。每个部位分别记录肿瘤细胞和邻近正常上皮细胞的染色分数。记录免疫染色百分率及染色强度(0：阴性；1+：弱；2+：中等强度；3+：强)。H-score的计算公式如下: H-score=(强度较弱%×1)+(中等强度%×2)+(强度较强×3)；最大H值为300，对应100%强度较强细胞。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 Ki-67在MCF-7/PGRMC1及MCF-7/vector乳腺肿瘤组织中的表达

与转染空载体的乳腺癌细胞MCF-7(MCF-7/vector)相比，稳定表达PGRMC1的乳腺癌细胞MCF-7肿瘤模型乳腺肿瘤组织中的Ki-67表达明显升高(P<0.001)，差异有统计学意义，详见表1。

2.2 他莫昔芬对MCF-7/PGRMC1裸鼠乳腺肿瘤组织Ki-67表达的影响

在转染PGRMC1裸鼠组，与单独给予E2相比，E2+TAM联合治疗可降低肿瘤组织中Ki-67的表达，差异有统计学意义(P<0.001)。而给予E2+黄体酮并未促进Ki-67的表达(P>0.05)。与单独给予E2相比，E2+黄体酮+TAM中Ki-67的表达明显降低，差异有统计学意义(P<0.001)，详见图1，表2。

图1 MCF-7/PGRMC1各亚组裸鼠乳腺肿瘤组织中Ki-67表达的比较Fig.1 Comparison of Ki-67 in breast cancer tissues of MCF-PGRMC1 subgroups

E2：estradiol；Prog:progesterone;TAM:tamoxifen;PGRMC1:.progesterone receptor membrane component 1；***P<0.001vsE2 group.

2.3 Ki-67在MCF-7/PGRMC1及MCF-7/vecter乳腺肿瘤组织中IHC结果

与转染空载体的乳腺癌细胞MCF-7相比，稳定表达PGRMC1的乳腺癌细胞MCF-7肿瘤模型乳腺肿瘤组织中的Ki-67阳性率明显升高，详见图2。

表1 Ki-67在MCF-7/PGRMC1及MCF-7/vector乳腺肿瘤组织中的表达Tab.1 Comparison of Ki-67 in MCF-7/PGRMC1 and MCF-7/vector breast tumor tissues

表2 他莫昔芬对MCF-7/PGRMC1裸鼠乳腺肿瘤组织Ki-67表达的比较Tab.2 Comparison of tamoxifen on the expressionin of Ki-67 in breast tumor tissues of MCF-7/PGRMC1 nude mice

图2 Ki-67在乳腺肿瘤组织中的表达Fig.2 Expression of Ki-67 in breast tumor tissue from mice

Scalebars：100 μm， signals for Ki-67 brown colour, nuclei blue；E2：estradiol；Prog:progesterone;TAM:tamoxifen;PGRMC1:progesterone receptor membrane component 1.

3 讨论

乳腺癌是我国女性发病率和病死率最高的恶性肿瘤，其发病率年增幅是世界平均水平的2倍，发病高峰为40～50岁，相较于美国乳腺癌患者的中位诊断年龄64岁，中国约48～50岁，比欧美国家提前约15年[3]。Beatson于1896年发现切除乳腺癌患者的卵巢后其乳腺肿瘤病灶会缩小，表明乳腺肿瘤的生长需依赖于内分泌环境，雌激素能促进乳腺肿瘤的发生[4]，而内分泌治疗可阻断乳腺肿瘤生长环境，使细胞的增生于G0 /G1期停止，达到缩小肿瘤的效果，故内分泌治疗逐渐被应用于乳腺癌的治疗[5]。美国国立卫生研究所推荐TAM为所有ER阳性的乳腺癌患者术后辅助治疗的标准药物，其也是第一个被美国食品药品监督管理局批准用来减少绝经前、后乳腺癌妇女高危因素的肿瘤化学预防药物[6-7]。

TAM是一种结构与雌激素相似的人工合成的非甾体类抗雌激素药，属于雌激素受体调节剂，通过与雌激素竞争靶细胞胞质中的ERα，抑制ERα功能，阻止雌激素发挥作用从而抑制乳腺癌细胞的增生[8]，是ERα阳性乳腺癌患者内分泌治疗的首选药物。TAM须在肝脏内进行代谢，最终代谢为4-羟基-他莫昔芬和4-羟基-N-去甲他莫昔芬(吲哚昔芬)，后两者的活性是他莫昔芬的100倍。由于吲哚昔芬的血浆浓度高，能够显著抑制ER阳性乳腺癌细胞的增生能力。所以通常认为吲哚昔芬是TAM的主要代谢活性物质，在抗雌激素治疗中起重要作用[9]。研究[10]表明，TAM能够显著减低ERα 阳性乳腺癌患者的病死率，接受TAM治疗能显著降低乳腺癌的复发及对侧乳腺癌的发生风险，服用TAM 5年后，复发风险在 50～<60岁女性中降低 37%，在 60～<70岁女性中降低54%，持续服用10年能显著降低乳腺癌的复发率和病死率。

在我国应用TAM治疗5～10年已经成为绝经前激素受体阳性早期乳腺癌患者的标准内分泌治疗方式[10]，但我国绝经前女性早期乳腺癌患者中激素受体阳性者仅占50%～60%。另外，在不同的组织、靶器官中，TAM可体现不同作用，即对乳腺组织主要发挥雌激素受体的拮抗作用，而对于子宫则主要表现弱雌激素活性。因为TAM化学结构与雌激素相似，存在Z和E两种构型，Z型具有抗雌激素样作用，E型却具有弱雌激素活性，而TAM在不同组织中分布不同[11]，故当TAM抑制ER阳性的乳腺癌细胞生长时，却刺激子宫内膜细胞增生，子宫内膜腺体呈囊性扩张样水肿或形成息肉，腺上皮细胞萎缩或化生，使子宫内膜呈现息肉-增生-恶性变的变化过程[12]。癌症基因组图谱研究[10-11]显示，长期应用TAM 10 年和 5 年的子宫内膜癌发生率分别为3.1%和1.6%，但相较于TAM能显著降低乳腺癌患者复发风险，其对于子宫内膜的不良影响仍无法替代其在乳腺癌治疗中的使用地位。

PGRMC1是一种新的乳腺癌细胞膜七跨膜受体，有一个短的胞外结构域及跨膜域和胞质域，属于广泛存在于真核生物中的膜相关的孕激素受体蛋白 ( membrane-associated progesterone receptor protein，MAPR) 家族。PGRMC1在介导孕激素的非基因组效应中发挥重要作用，在体内参与卵泡发育、精子的顶体反应等生理过程；还能够与血红素直接结合激活细胞色素P450参与调节体内类固醇、药物代谢及性激素的合成[13]。此外，多种肿瘤中均发现PGRMC1表达异常，如乳腺癌[14-16]、卵巢癌、肺癌等。本课题组前期研究[17]显示：体外雌、孕激素对MCF-7 /PGRMC1与未转染 PGRMC1 的乳腺癌细胞(MCF-7)增生作用有明显不同，雌激素和某些孕激素明显增加了转染PGRMC1的乳腺癌细胞的增生，并可能参与肿瘤的发生；且PGRMC1与肿瘤直径、淋巴结转移之间关系密切，根据PGRMC1的不同阳性表达水平来分析 PGRMC1与乳腺癌患者复发、远期生存情况之间的关系发现：在总体生存率方面，随着PGRMC1表达强度逐渐增强，患者总体生存率下降；在无瘤生存率方面，随着PGRMC1表达阳性水平增加，远期术后复发时间间隔短[18]。因此，PGRMC1是乳腺癌的独立预后因子，对于ERα表达阳性的个体，还可以通过评估 PGRMC1表达水平对患者预后做出更好的预测。Peluso等[19]发现PGRMC1除了在肿瘤形成中起着重要作用，敲除PGRMC1后卵巢癌细胞SKOV-3成瘤下降，成瘤小鼠的成瘤大小减少55%，且缺失PGRMC1，SKOV-3更容易对顺铂耐药。因此，明确PGRMC1与TAM的相互作用有助于肿瘤的病因、预后及耐药学研究。

自2013年6月免疫组织化学问世以来，乳腺癌的治疗基于ER、孕激素受体和人类表皮生长因子受体2状态，而Ki-67的测定及其与临床病理参数的关系具有预后和预测意义[20]。Ki-67是细胞增生标志物，其表达增强是细胞增生活性增强的可靠标记，该标志物在乳腺癌临床治疗中具重要意义：Ki-67与肿瘤分级有一定的关联，Ki-67与乳腺癌患者其他生物学标志物之间的关系也是一直以来研究的内容。根据1991年Elston和Ellis标准[21]，有丝分裂活动是乳腺癌分级系统的三个主要组成部分之一，除了G0静止期外，Ki-67增生指数存在于细胞周期的不同阶段。Ki-67表达水平与肿瘤分级呈正相关。肿瘤分级越高，Ki-67表达越高。反之亦然，Ki-67表达越高，肿瘤分级越高，恶性肿瘤的侵袭性也越强，对患者的生存造成的危害越大，如早期复发、转移。除了肿瘤分级外，Aman等[22]研究发现Ki-67的表达是一个连续变量，还与组织学类型、分子亚型、ER、PR有关。ER、PR阳性者Ki-67表达较低，而HER2在Ki-67高表达患者中也呈高表达状态。Ki-67增殖生数和诺丁汉分级明确了乳腺癌的侵袭性，从而证实了其预后意义。王志新等[23]对 42 例绝经后乳腺癌患者服用TAM后子宫内膜中 Ki-67及pten基因的表达进行测定，结果显示，与对照组相比，TAM组表现出Ki-67高表达及pten低表达或缺如。Ki-67高表达引起内膜细胞增生、pten基因突变，其对抑癌作用的抑制可能是TAM治疗者发生子宫内膜病变的发病机制中的重要环节。本研究结果与既往报道[22]一致：肿瘤组织中Ki-67高表达；E2+TAM及E2+黄体酮+TAM联合治疗可降低肿瘤组织中Ki-67的表达，免疫组织化学的结果与上述一致。在本实验室前期工作证明，PGRMC1可以使肿瘤细胞生长曲线加快、加入TAM后肿瘤生长曲线速度减慢。故推测PGRMC1可能通过加快细胞增生、增加Ki-67表达来促进肿瘤生长，而TAM治疗后可通过降低Ki-67表达拮抗PGRMC1导致的乳腺肿瘤细胞增生。

综上所述，PGRMC1作为细胞膜受体，可能通过加快细胞增生、增加Ki-67表达来促进乳腺肿瘤生长，后期可通过验证TAM对于转染PGRMC1肿瘤子宫内膜影响，进一步明确PGRMC1表达水平与TAM所致子宫内膜增厚之间的关系，可能为乳腺癌的内分泌治疗方案及子宫内膜增厚的预防制定提供新思路。