复苏后常温条件下卵巢组织活性与时间关系的初步探究

金凤羽 阮祥燕,2* Alfred O. Mueck，2 杜 娟 李扬璐 程姣姣 王虎生

(1.首都医科大学附属北京妇产医院内分泌科，北京 100026；2.德国图宾根大学妇产医院妇女健康部与妇女健康研究中心，图宾根 D-72076，德国)

随着人类医学的进步和肿瘤治疗学的发展，肿瘤患者的5年生存率有了很大的提高，年轻癌症患者的5年生存率高达83%左右[1]。这些患者在肿瘤病痛缓解或治愈之后却又常常面临另外一个严峻的问题，在接受细胞毒性抗癌化学药物治疗或放射治疗之后生育能力往往受到严重破坏，致使生活质量受到很大影响，甚至不孕，家庭婚姻关系因此破裂者不在少数。因此，对这些女性患者，尤其是青春期前的进行生殖力保护是非常重要和必要的。根据中国和德国妇产科协会(German Society of Gynecology and Obstetrics，DGGG)[2]在2018公布的指南，所有年轻恶性肿瘤患者应同时接受肿瘤学家和生殖力保护专家的咨询。

卵巢组织冷冻保存是保护女性生育能力的重要方法之一，是青春期前女孩或需要立即治疗的患者的唯一可行选择[3-4]。到2018年1月，根据报道[4]通过该项技术累计共有130多个婴儿出生，且该数量呈几何式上升。因此，Lambertini等[5]认为卵巢组织冻存技术能够很好地保护女性生殖力，因此不应该再停留在实验室阶段而是广泛应用于临床。

为了进一步完善这种新型技术，提高临床妊娠率，在冻存技术本身以及手术方面等方面展开了相关研究[6-8]，包括冷冻保存程序、冻存保护剂以及移植部位，然而卵巢组织复苏后转运条件的研究鲜有报道。鉴于这种情况，本研究的主要目的是通过对复苏后常温情况下存放不同时间的卵巢组织进行活性检测，借此评估复苏后的时间推移是否影响卵巢组织的活性。

1 材料与方法

1.1 材料

就诊于首都医科大学附属北京妇产医院，需要手术治疗的卵巢肿瘤患者或需要进行卵巢组织冻存以保护生殖力的患者共13名，经患者知情同意后，腹腔镜下冷刀取部分卵巢组织，置于康斯特保护液中(4 ℃)迅速转运到首都医科大学北京妇产科医院卵巢库实验室。本研究经首都医科大学附属北京妇产医院伦理委员会审批，伦理审批号：2017-KY-020-1。在实验室中，去除卵巢组织的髓质和血管，仅保留皮质部分，最后将卵巢组织制作成为直径2 mm，厚度1 mm的圆形标本，其中生殖力保护患者用于研究的卵巢组织不得超过取材总量的10%。每位患者共取标本9个，采用数字表法随机将其中1个新鲜标本进行卵泡计数，剩余的8个标本进行程序化冷冻。液氮中保存至少1周后进行复苏，复苏后按照常温存放时间的不同分为4组，即组1(0 min)、组2(20 min)、组3(40 min)和组4(60 min)，每组2个标本，置入含有培养液的24孔板中进行独立培养。4 d后收集培养液进行雌激素、乳酸以及葡萄糖代谢浓度测定，卵巢组织标本进行卵泡计数。

1.2 程序化冷冻、复苏培养

冻存液是由Leibovitz’s L-15(Gibco公司，美国)、1%(体积分数)人血清白蛋白(IrvineScience公司，美国)和10%(体积分数)CryoSure-DMSO(WAK-Chemie Medical GmbH)按照比例配置而成。卵巢组织标本制作完成后，每2个标本放入含有1.5 mL冻存液的无菌冻存管内进行程序化冷冻。冷冻程序参照文献[9]。首先，将卵巢组织置入4 ℃冻存液中平衡15 min。然后将含有卵巢组织的无菌冻存管转移到程序冷冻仪内进行程序化冷冻(PLANER，GDKRYO360CH-1.7-230)。降温速度：在最初的5 min内，降温速度为2 ℃/min，待冻存管温度降至-6 ℃时进行人工诱导冰晶形成。然后按照0.5 ℃/min的速度继续降温至温度达到-40 ℃，最后按照50 ℃/min的速度迅速降至-140 ℃。冷冻完成后将无菌冻存管转移至-196 ℃液氮储罐中储存，7 d以后进行复苏。

复苏液由9 mL DPBS(Gibco公司，美国)和1 mL人血白蛋白(IrvineScience公司，美国)组成。复苏时对每位患者的8个标本同时进行复苏。复苏过程：①取出储存在液氮罐内的冻存管，置于37 ℃的水浴箱中2 min。②从冻存管内取出卵巢组织标本，依次转移到6孔板中进行洗涤、平衡。前3孔每孔内含复苏液10 mL，蔗糖含量分别为(0.75、0.45、0.125 mol/L)，每隔15 min将卵巢组织标本转移至下一个孔内，共3次。第4孔和第5孔内仅含复苏液，不包含蔗糖。卵巢组织在第4孔内平衡10 min后转移至第5孔内继续平衡。5 min后复苏完成。

在复苏完成后的第0、20、40、60 min时采用数字表法随机选取2个卵巢组织标本转移至含有1 mL培养液的24孔板内进行独立培养。培养液由90%(体积分数)DMEM(4.5 g/L D-glucose)和10%(体积分数)人血白蛋白按照比例配置而成。培养箱温度37 ℃，5%(体积分数)CO2，95%湿度。4 d后收集培养液测定其中雌激素、孕激素、乳酸的浓度，卵巢组织进行卵泡计数。

1.3 卵泡计数及雌激素、乳酸和葡萄糖测定

由于钙黄素AM(calcein AM)只能在活细胞中才能被转化为荧光钙黄素，并产生荧光绿色染色。因此，本研究采用Calcein AM(美国Sigma公司)对卵巢组织进行染色后在495 nm荧光显微镜下观察，对所有活性卵泡进行计数。

本研究采用酶联免疫吸附法测定培养液内的雌激素的浓度，采用比色法/吸收法测定乳酸以及葡萄糖浓度。雌激素测定试剂盒购自德国DRG公司，乳酸及葡萄糖测定试剂盒购自美国Biovision公司。

1.4 统计学方法

本研究采用SPSS 17.0统计学软件对实验数据进行统计学分析。就卵泡计数而言，新鲜卵巢组织组和复苏后第0分钟(组1)两组之间的差异采用两个独立样本的t检验或t’检验。为了确定时间变化是否会对卵泡活性以及卵巢组织整体活性产生影响，对复苏后不同时间点4组的卵泡计数，雌激素、乳酸浓度和葡萄糖分别进行了重复测量设计的方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料

收集2014年至2017年期间就诊于首都医科大学附属北京妇产医院的13名育龄期女性的卵巢组织，这些女性患有卵巢良性囊肿需要腹腔镜手术治疗或需进行卵巢组织冻存。所有患者月经规律，平均年龄(34±5.4)岁，其中宫颈癌9例，乳腺癌1例，卵巢囊肿1例。

2.2 卵泡计数比较

新鲜卵巢组织组和组1(复苏后第0分钟)的活性卵泡平均数为33.360±45.857和30.680±32.884。两组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。复苏后不同时间点(复苏后第0，20，40，60分钟)卵泡计数无明显下降，4组间进行重复方差分析，差异无统计学意义(P>0.05)(图1)。

2.3 4组雌激素浓度比较

复苏后4组培养液内的雌激素平均浓度分别为5.231±0.637,5.121±0.734,5.042±0.991和5.895±1.106(pg/mL)，4组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)，详见表1。

图1 复苏不同时间点荧光显微镜下及光学显微镜下卵泡(100×)Fig.1 Follicles at different time points after thawing under fluorescence and optical microscopy

ItemNumberofcaseGroup1Group2Group3Group4FPEstrogen/(pg·mL-1)135.231±0.6375.121±0.7345.042±0.9915.895±1.1060.8920.356Lactate/(mmol·L-1)133.931±8.6273.581±9.1043.265±0.4983.087±0.5560.2290.638Glucose/(ng·mL-1)1315.575±1.02016.040±1.35917.037±6.04218.081±9.1331.7590.220

Group1:0 min;Group2:20 min；Group3:40 min；Group4:60 min.

2.4 4组乳酸浓度比较

复苏后随着时间的推移，培养液内的乳酸浓度呈下降趋势，组1乳酸浓度最高为(3.931±8.627)mmol/L，组4最低为(3.087±0.556)mmol/L。但这4组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)，详见表1，图2。

2.5 4组葡萄糖浓度比较

培养液内的葡萄糖浓度呈上升趋势，组1葡萄糖浓度最低为(15.575±1.020)ng/mL，组4最高为(18.081±9.133)ng/mL，然而这种上升趋势差异无统计学意义(P>0.05)，详见表1，图3。

3 讨论

卵巢组织冻存为青春期前女性以及迫切需要进行放射治疗联合化学药物治疗(以下简称放化疗)的育龄期女性提供了保留生殖力的希望。但是由于这项技术从实验室走向临床的时间仅仅数十年，仍需要大量的相关研究和数据进一步优化，这不仅包括了最重要也是争议最多的冻存方案，同时也应该包括卵巢组织取材、卵巢组织冻存、卵巢组织复苏以及卵巢组织再移植等所有环节中的可能影响因素，例如复苏后的转运条件以及转运时间限制。然而截止到目前，卵巢组织冻存技术相关研究多数集中在冻存方案和冻存保护液方面，其他影响因素鲜有报道，亟待更多相关研究。

图2 复苏后4组乳酸浓度随时间变化趋势Fig.2 Trend of lactate levels with time after thawing

Group1:0 min after thawing;Group2:20 min after thawing;Group3:40 min after thawing;Group4:60 min after thawing.

图3 复苏后4组葡萄糖浓度Fig.3 Trend of glucose levels with time after thawing

Group1:0 min after thawing;Group2:20 min after thawing;Group3:40 min after thawing;Group4:60 min after thawing.

由于程序化卵巢组织冻存技术对实验室设备和相关技术人员有一定水平的要求，因此在欧洲建议采取中心化管理模式[5]，其他一些地区的女性可以通过冷链等方式将卵巢组织转运到那些具有条件的医院和实验室进行卵巢组织冻存，而复苏后则要求尽快将卵巢组织移至体内，实验室和手术室需要近在咫尺，大大限制了这项技术的推广。此外，手术本身是一件随时可能意外的发生，如果卵巢组织如期复苏完毕，而因为腹腔内大量粘连、出血等因素导致移植部位不能在预期的时间内完成准备工作，可能会患者造成不可逆的损失。因此为了避免上述情况的发生，临床工作中往往会选择在确认患者移植部位已经准备完毕后再启动复苏程序(整个复苏过程至少1 h以上)，不可避免地延长了手术时间，增加了患者的负担。然而该研究发现复苏后在常温条件下，卵巢组织在1 h内活性卵泡个数以及卵巢组织整体活性并没有出现明显下降，因此严格地等待患者移植部位手术准备完毕再启动复苏程序很可能是不必要的。

卵泡计数是反应卵巢组织活性的一个非常重要的指标，本研究中在新鲜组和复苏后组1(复苏后第0分钟)之间，复苏后4组间卵泡计数差异均无统计学意义。然而卵泡计数评估卵巢组织活性存在着一定的缺陷，卵泡只有在严重受损后几小时才会出现组织改变并能被现有得检测技术所检测出来[9]，因此卵泡计数以及完整性并不能完全地反映组织真正的受损情况，仍需要结合其他指标进行评估卵巢组织整体活性[10-12]。雌激素是由活性卵泡分泌产生的一种类固醇激素，通过测定培养液内雌激素的浓度可以在很大程度上反映出组织中卵泡的活性情况，从而弥补单纯卵泡计数评价卵巢组织活性的不足[11]。乳酸以及葡萄糖代谢的测定可以用于评估复苏后卵巢组织整体活性情况，乳酸浓度越低提示卵巢组织活性下降越严重。反之，葡萄糖浓度越高提示组织对葡萄糖的摄取越少，意味着组织活性越差[13]。在本研究中，对复苏后4组培养液内的雌激素、乳酸以及葡萄糖浓度进行比较，差异无统计学意义(P>0.05)，均提示复苏后的卵巢组织在短时间内无论是卵泡计数还是组织整体活性情况都没有发生明显下降。但由于受样本量的限制，本项研究仅对复苏后1 h内的卵巢组织活性进行评估，没有发现明显下降。然而复苏后等待时间继续延长，卵巢组织的活性是否会下降尚无可预知，仍需进一步研究。此外，本研究仅对能卵巢组织活性的几个重要指标进行了观测，是否会影响再移植卵巢组织存活仍需临床进一步验证。复苏后常温条件下卵巢组织在1 h内卵泡计数无显著性减少，卵巢组织整体活性无显著性下降。