低氧预处理人脐带间充质干细胞治疗早发性卵巢功能不全小鼠的效果研究

赵 越 阮祥燕,2* 王凤春 李扬璐 程姣姣 Alfred O. Mueck,2

(1.首都医科大学附属北京妇产医院内分泌科，北京 100026；2. 德国图宾根大学妇产医院妇女健康部与妇女健康研究中心，图宾根 D-72076，德国；3.首都医科大学附属北京妇产医院产房，北京 100026)

早发性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency, POI)是女性在40岁之前卵巢活动衰退的临床综合征，以月经紊乱(如停经或稀发月经)、卵巢萎缩、体内雌激素水平低落、促性腺激素高达绝经期水平的现象，继续进展在40岁前卵巢功能衰竭，就会导致卵巢早衰(premature ovarian failure, POF)，严重影响女性生殖健康和内分泌平衡[1]。由于国内缺乏权威的流行病学调查，以往文献[2]显示卵巢早衰在育龄女性中发病率约为1%。在当今高压力、快节奏的影响下，POI发病率呈上升和年轻化趋势，已影响了超过10%的女性健康[3]。POF治疗极为困难，即使通过辅助生殖技术，也很难实现受孕[4]，POI导致的生育力丧失及低雌激素状态给女性生殖健康带来了巨大威胁。鉴于常规治疗方法的局限性，临床和科研工作的关注点集中在改善POI患者卵巢功能及恢复生育能力。人脐带来源的间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)，来源丰富，易采集，病原微生物感染率和免疫原性较低，无致瘤性和伦理限制等优点[5-7]，为改善POI/POF患者卵巢功能及恢复生育能力带来了希望，相关分子机制的探究更是为POI/POF合并不孕症患者精准治疗提供了一个很有价值的研究方向。研究[8]表明，短期低氧刺激在早期会抑制细胞的活力及增生，引起细胞损伤甚至凋亡，但随后细胞为了适应低氧环境，又反而会增强其迁移能力，激活一些促进存活的信号通路，表达一些生长因子等，如低氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1, HIF-1)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)及干细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)等。本研究应用hUCMSCs来治疗因化学治疗药物引起的POI小鼠，同时与低氧预处理的hUCMSCs治疗效果进行比较，通过检测小鼠血中激素水平及小鼠卵泡发育情况，研究hUCMSCs及低氧预处理条件下hUCMSCs对POI小鼠的治疗作用，为临床研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级CD-1小鼠，雌性，6～7周龄，60只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物许可证号：SCXK(京)2016-0006。饲养于首都医科大学实验动物部，饲养所用食物、垫料、水、笼具等均经严格消毒灭菌处理，按首都医科大学实验动物伦理委员会批准方案进行实验(伦理编号：AEEI-2015-112)。

1.2 主要试剂及仪器

1, 4-丁二醇二甲烷磺酸盐(白消安)及环磷酰胺单水合物，购自上海化成工业发展有限公司。鼠雌二醇(estradiol，E2)ELISA试剂盒、鼠卵泡刺激素(follicle stimulating hormone,FSH)ELISA试剂盒及鼠抗苗勒管激素(anti Müllerian hormone, AMH)ELISA试剂盒，购自上海酶联生物科技有限公司。PE鼠抗人CD73、APC鼠抗人CD90、BV421鼠抗人CD105、APC鼠抗人CD14、APC鼠抗人CD19、APC鼠抗人CD34、 APC鼠抗人CD45、APC鼠抗人人白细胞抗原-D(human leukocyte antigen-D，HLA-DR)抗体购自美国BD公司。Multiskan FC型酶标仪、3111型二氧化碳培养箱购自上海赛默飞世尔科技有限公司。

1.3 hUCMSCs的取材、分离、培养、鉴定及低氧诱导

选取自然分娩健康足月新生儿的健康产妇共20例，无任何疾病史，定期产检，无任何产科合并症，同时排除梅毒、肝炎、艾滋病等传染病，经产妇同意，胎盘娩出后，无菌条件下留取新鲜脐带组织10 cm，脐带中无明显血管迂曲，放在组织保存液中。实验经首都医科大学附属北京妇产医院伦理委员会批准通过。所有入组参加研究者均自愿签署知情同意书。

脐带采集后在6 h内进行处理，将脐带双侧带夹痕及瘀血的部分切除，并剃除脐带中的静脉及动脉，将剩余组织剪成3.0～5.0 mm3小块，种入预先用少量完全培养基湿润的T25细胞培养瓶底壁，将培养瓶底壁朝上置于37 ℃、为5%(体积分数)的CO2饱和湿度孵箱中，过夜后翻转。每24 h加入1 mL上述培养基，72 h后全量换液，以后每周换液2次。观察贴块周围贴壁细胞爬出情况。2周后去贴块，于培养的第14天计数集落数。当细胞达70%～80%融合时，以含1.25 g/L胰蛋白酶、1 g/L乙二胺四乙酸的消化液消化后，以2.5×103～5.0×103/cm2密度接种传代培养，计为第1代(P1)细胞。取第2代的间充质干细胞，胰酶消化后制成单细胞悬液。分别加入抗人CD29、CD44、CD73、CD105、CD90、CD14、CD34、CD45、CD106、CD133、HLA-DR单抗各5 μL，鼠IG为阴性对照，4 ℃孵育30 min，流式细胞仪检测。

低氧诱导脐带间充质干细胞的步骤为上述正常培养的脐带间充质干细胞达到70%～80%融合时，更换新鲜培养基，置于37 ℃，充满体积分数为1% O2、5% CO2及94%氮气的培养箱中，连续培养48 h，收取细胞制备单细胞悬液。未进行低氧诱导的脐带间充质干细胞则当细胞培养达到 70%～80% 融合时，收取细胞制备单细胞悬液。

1.4 小鼠POF模型建立及干细胞治疗

雌性CD-1小鼠60只，在动物房后适应性饲养1周后开始建模。按体质量采用数字表法随机分为4组，每组15只，分别为：正常对照组(A组)、POF模型对照组(B组)、 hUCMSCs组(C组)、低氧hUCMSCs组(D组)。除A组外，各组小鼠分别皮下注射白消安(12 mg/kg，溶于DMSO)和腹腔注射环磷酰胺[120 mg/kg，溶于0.9%(质量分数)氯化钠注射液]，A组分别注射等体积DMSO和0.9%(质量分数)氯化钠注射液，每日8∶ 00棉签轻取阴道分泌物涂片，巴氏染色，观察阴道脱落细胞变化，当连续10 d观测到持续动情间期，视为POI建模成功[6]，造模1周后给药。C组和D组小鼠分别静脉注射hUCMSCs单细胞混悬液和低氧诱导hUCMSCs单细胞混悬液(100 μL每鼠，含细胞数量为2 × 106个)。

1.5 观察指标

在实验第21天分别从各组中取5只小鼠，眼球采血，肝素抗凝，分离血浆于-80 ℃ 冻存，择期检测其E2、FSH、AMH含量；收集小鼠卵巢，以甲醛固定后，行组织病理学检查，进行卵泡计数。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 hUCMSCs形态学观察

经分离、培养得到的hUCMSCs均贴壁生长，呈均一的梭形，涡旋状排列(图1)。

2.2 流式细胞术检测hUCMSCs表面标志物

分离培养的第二代hUCMSCs流式细胞术检测结果，阳性标志物：CD73、CD90和CD105阳性率均大于 95%，阴性标志物：CD14、CD19、CD34、CD45和HLA-DR均不高于2%(图2)。

2.3 激素水平

与A组比较，B组小鼠血浆E2及AMH降低(P<0.05)，差异有统计学意义。与B组比较，C组和D组的小鼠血浆中E2及AMH(P<0.05)，差异有统计学意义；B组小鼠血浆FSH有所上升，但各组差异无计学意义(表1)。

图1 hUCMSCs光镜图Fig.1 Optical microscope of hUCMSCshUCMSCs: human umbilical cord mesenchymal stem cells.

图2 hUCMSCs表面标志物的流式鉴定Fig.2 Flow characterization of surface markers of hUCMSCshUCMSCs: human umbilical cord mesenchymal stem cells.

GroupNumberofcasesE2/(pmol·L-1)FSH/(mIU·mL-1)AMH/(pg·mL-1)A1536.96±2.886.35±2.612923.75±166.98B1531.71±3.49∗6.77±2.362221.53±249.25∗C1534.21±3.22#6.15±2.582513.50±240.51#D1534.43±3.16#6.29±2.252679.82±126.24#F-11.691.388.50P-0.0280.3050.003 ∗P<0.05vsgroupA;#P<0.05vsgroupB;E2:estrogen;FSH:folliclestimulatinghormone;AMH:anti-Müllerianhormone;hUCMSCs:humanumbilicalcordmesenchymalstemcells;A:control;B:POFcontrol;C:normalhUCMSCs;D:hypoxicpretreatedhUCMSCs;POF:prematureovarianfailure.

2.4 卵巢组织HE染色形态学观察和各级卵泡计数

采取连续切片法，每张切片厚度5μm，取10张切片，常规HE染色，镜下观察各组标本的切片中各阶段(始基卵泡、初级卵泡、次级卵泡和成熟卵泡、闭锁卵泡)卵泡情况，同时观察卵巢中颗粒细胞、黄体及间质等组织学变化。结果显示，A组小鼠卵巢体积较大，可见生长活跃、发育良好的各级卵泡和黄体，卵巢组织未见炎性细胞浸润。B组小鼠卵泡萎缩明显，结构混乱，各阶段生长卵泡数目明显减少，仅有少数原始卵泡，卵巢卵母细胞周边颗粒细胞明显减少、排列紊乱、细胞间隙增大。C、D组卵巢组织中空泡及闭锁卵泡明显减少，颗粒细胞数量增多且呈放射状整齐排列，并开始出现各级卵泡，成熟卵泡明显增多，可见较多排卵前的窦状卵泡。卵巢颜色红润，尺寸增大，透明度好，整体来看与A组卵巢状态相似(图3)。与A组相比，B组原始卵泡、生长卵泡数量明显减少(P<0.05)、闭锁卵泡数量明显增多(P<0.05)；与B组相比，C、D组生长卵泡明显增多、闭锁卵泡明显减少(P<0.05)。与C组相比，D组生长卵泡数量有增加趋势、闭锁卵泡数量趋于减少，在21 d治疗时间点两组差异有统计学意义(P>0.05)，详见表2。

图3 各组小鼠卵巢组织HE染色结果Fig.3 HE staining results of ovarian tissue in each group of mice

A:control;B:POF control;C:normal hUCMSCs;D:hypoxic pretreated hUCMSCs;A1、B1、C1、D1:HE staining (10×),A2、B2、C2、D2:HE staining (40×);hUCMSCs: human umbilical cord mesenchymal stem cells;POF:premature ovarian failure;HE:hematoxylin and eosin.

GroupNumberofcasesPrimordialfolliclesGrowingfolliclesAtreticfolliclesA1573.20±6.02161.05±34.2425.40±4.38B1559.67±7.89∗99.82±33.51∗35.80±2.95∗C1560.32±5.72143.49±25.54#20.62±2.79#D1558.43±5.05148.80±23.39#19.66±2.45#F-8.1210.899.66P-0.0470.0290.039 ∗P<0.05vsgroupA;#P<0.05vsgroupB;A:control;B:POFcontrol;C:normalhUCMSCs;D:hypoxicpretreatedhUC-MSCs;hUCMSCs:humanumbilicalcordmesenchymalstemcells;POF:prematureovarianfailure.

3 讨论

POI已成为威胁正常生育年龄女性生殖系统健康的最大问题之一，其发生可能与各种原因引起的始基卵泡池储备不足、卵泡闭锁加速、优势卵泡募集改变、卵泡成熟障碍等有关[9-10]。近年来，采用间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)移植治疗开拓了POI治疗全新的方向，但大部分处于临床前研究阶段[11-13]，临床研究鲜有报道，而且对MSC改善卵巢功能的作用机制尚不完全清楚，目前临床尚没有明确有效的治疗措施能恢复其生殖功能。

本课题组成功建立了hUCMSCs分离培养鉴定的全套技术设备。流式技术检测间充质干细胞表面特异性抗原CD44和CD90，不同传代次数细胞阳性率均保持在99%水平，提示本研究中分离培养的hUCMSCs纯度较高，分离和培养方法合适，符合国际细胞治疗协会(International Society for Cell Therapy, ISCT) MSCs表型鉴定标准[14]。本研究采用化学治疗药物诱导的小鼠POI模型来评价正常培养下hUCMSCs及低氧预处理hUCMSCs对POI的治疗作用，发现两个治疗组血中E2及AMH浓度较治疗前明显增加，说明hUCMSCs移植治疗改善了卵巢早衰小鼠的卵巢内分泌水平，增加了卵巢储备功能，从而延缓卵巢功能衰退。同时组织病理学结果证实，经hUCMSCs移植治疗后，POI小鼠卵泡的数量和质量都得到一定程度的恢复，各级卵泡的比例也趋向于正常化，说明干细胞移植后促进了POI小鼠卵巢中卵泡的恢复及再生，进一步证实了hUCMSCs对POI的治疗效果，与以往报道[15-16]类似。干细胞移植入体内后面临氧分压、炎性环境等复杂的微环境，对其存活及进一步的疗效都可能产生负面的影响，而经短期低氧预处理后，干细胞会活化一些利于其适应低氧环境的信号通路，增强其可塑性、血管再生能力等，同时调控多种生长因子的分泌，以利于其存活[17-18]。本研究中低氧预处理MSC组小鼠在血浆E2及AMH浓度、生长卵泡和闭锁卵泡数量方面，均较正常MSC治疗组出现对疗效更有利的趋势，这也在一定程度上印证了低氧预处理干细胞的优势。

本研究为hUCMSCs治疗POI进一步的临床前研究提供了理论基础和启示，但在hUCMSCs促进卵泡恢复的详细机制、移植方式、移植部位与数量、移植时间窗、移植后干细胞的归巢、移植前对干细胞的处理和改造，以及后期临床上卵巢功能恢复评价指标的选择等方面，尚需要进一步的探索，以便充分发挥干细胞的治疗效果。