子宫内膜异位症原代细胞培养及纤维化相关蛋白检测

张艳芹 吴 迪 邓梦琪 常翔宇 苗劲蔚

(首都医科大学附属北京妇产医院妇瘤科，北京 100006)

子宫内膜异位症 (endometriosis，EMs)是指子宫内膜腺体和基质异位到宫腔以外的部分，以卵巢、子宫直肠陷凹、子宫骶韧带等部位最常见，是生育期女性常见病、多发病，发病率高达7%～10%[1]。EMs患者中更是高达50%伴有不孕或盆腔疼痛[2]。EMs患者的异位病灶与正常在位子宫内膜相似有明显的激素依赖性，就EMs发病的侵蚀性、复发性和激素依赖性特征又与恶性肿瘤的生长有很大的相似性。目前关于EMs发病有经血逆流、 体腔上皮化生等多种学说，其中以经血逆流学说最被接受[3]。然而研究[4]证明90%的育龄期女性都存在经血逆流现象，只有10%～15%的女性发病。可见经血逆流可能是EMs发病的重要诱因，但不是发病的决定因素。EMs不仅发病率高，而且治疗棘手，手术治疗后5年复发率高达50%[5]。更为严重的是近年来EMs纤维化患者特定类型卵巢癌的发病率较正常育龄期女性有明显的上升，目前研究[6]显示EMs的基本病变为异位的子宫内膜组织在雌激素的作用下周期性剥脱，出血并被其周围组织包裹继而发生纤维化，形成异位结节最终形成盆腔粘连，因而导致慢性盆腔疼痛、不孕、月经异常等一系列症状。为探索EMs发病的基础以及EMs纤维化与盆腔疼痛及不孕的关系，针对EMs发病及进展的基础医学研究成为EMs研究的重点。目前关于EMs纤维化的研究有建立永生化细胞系和内膜异位细胞原代培养两种方法。但无论是通过癌细胞诱导还是基因水平改变建立EMs纤维化细胞系，其代表性都远低于EMs细胞原代培养。因此本实验采用改进的EMs原代细胞分离方法，分离出EMs间质细胞。并使用分子生物学方法检测原代细胞纤维化相关蛋白的表达水平。探究EMs 异位子宫内膜间质细胞与EMs在位及正常在位子宫内膜间质纤维化相关蛋白表达的差异。

1 材料与方法

1.1 标本采集

收集2017年9月-2018年9月于首都医科大学附属北京妇产医院行手术治疗的EMs患者共12例及非子宫腺肌症子宫肌瘤患者9例。患者年龄22～48岁。所有患者术前未接受过激素类药物治疗，无其他女性生殖系统相关内分泌、代谢、免疫疾病。无恶性肿瘤病史。入院时心、肺、肝、肾等功能检查无明显异常。该研究经过首都医科大学附属北京妇产医院伦理委员会批准，伦理审批号：2018-KY-002-01。入选患者均签署知情同意书。

1.2 主要仪器

CO2细胞培养箱 (美国 Thermo Fisher Scientific公司) 、超净细胞工作台 ( 美国 Thermo Fisher Scientific公司)、微量可调移液枪(法国Glison公司) 、Eclipse TS100-F倒置光学显微镜 ( 日本 Nikon 公司) 、MULTIFUGE X3R 台式离心机(美国 Thermo Fisher Scientific公司) 和Precision GP 10 型水浴锅( 美国 Thermo Fisher Scientific公司)、不锈钢细胞筛直径74 μm，200目/150 μm，100目(南京公路牌)、免疫荧光显微镜(日本 Nikon公司)。

1.3 主要试剂

1∶1 DMEMs-F12培养基(美国Hyclone公司)，标准胎牛血清(美国Life公司)、1×PBS溶液(北京索莱宝公司)、 Ⅳ型胶原酶(美国Sigma公司)；0.25%(质量分数)胰蛋白酶-EDTA溶液(北京索莱宝公司)、鼠抗人波形蛋白(美国CST公司，D21H3)、兔抗CTGF抗体(美国CST公司，D8Z8U)、兔抗COL1A1抗体(美国CST公司，#84336)及兔抗α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)抗体(美国CST公司,D4K9N)、青链霉素(北京索莱宝公司)。

1.4 原代细胞分离培养

在严格无菌条件下，取新鲜EMs在位、异位及正常人子宫内膜组织，立即放入冰盒运输至实验室(从组织离体至细胞分离在2 h之内完整)。根据文献[7-8]所提供的EMs原代细胞培养方法进行不断实践及改进，通过新的实验方案对EMs子宫内膜间质细胞进行原代分离。具体分离操作：(1)在超净工作台内使用PBS将新鲜组织冲洗3次，清洗掉组织上的血液及巧克力囊液。(2)将组织分为两份，一份用组织标本固定液保存，用免疫组织化学法检测，另一部分放入6 cm细胞培养皿，用眼科剪剪成0.5～1.0 mm碎块，肉眼观呈糊状。(3)加入3倍体积已经预加温至37 ℃的0.25%(质量分数)Ⅳ型胶原酶-胰蛋白酶EDTA混合溶液，混匀置于37 ℃细胞培养箱中消化5～10 min，消化过程中不断吹打混匀。(4)消化后置于150 μm，100目细胞滤过网过滤。(5)将滤过液加入2倍体积的含10%(体积分数)FBS及1%(体积分数)1× PS双抗的1∶1 DMEMs-F12细胞培养基终止消化。(6)过滤后的上层组织回收至6 cm细胞培养皿再次加入3倍体积的预加温至37 ℃的0.25%(质量分数)Ⅳ型胶原酶-胰蛋白酶EDTA混合溶液继续消化10～15 min。同样重复上述步骤，将消化结束后的液体通过150 μm，100目细胞滤过网，过滤液加入2倍体积含FBS的完全培养液终止消化。(7)将所有滤过液收集一起，通过74 μm，200目细胞滤过网。(8)将过滤后的细胞悬着液转移入50 mL离心管中，700 r/min离心3 min，移除上清液(此处可保留1 mL离心后的细胞悬浮液，增加细胞回收数量)。(9)加入10%(体积分数)FBS及1%(体积分数)1×PS双抗的1∶1 DMEMs-F12细胞培养基，吹打成均匀的细胞悬液。以细胞密度为1×105/mL，接种于25 cm2的培养瓶中，置37 ℃、5%(体积分数)CO2培养箱中培养。(10)24 h即可观察间质细胞贴壁，48 h后换液，弃除未贴壁细胞，加入新鲜的完全培养基继续培养，以后每2～3 d换液一次。待细胞生长密度达80%～90%时即可用0.25%(质量分数)胰蛋白酶-EDTA消化传代。传代后细胞生长良好，6代内细胞形态及生长速度无明显变化。一般原代培养子宫内膜间质细胞8～10 d可长满，传代后细胞2～4 d即可长满。

1.5 间质细胞性质鉴定

通过普通免疫组织化学方法及荧光免疫组织化学法检测细胞爬片中波形蛋白(vimentin)的表达。(1)免疫组织化学法：将无菌的载玻片放入细胞培养皿中，制作细胞爬片，使用波形蛋白(vimentin) 1∶100浓度4 ℃孵育过夜，山羊抗兔二抗1∶200浓度37 ℃温箱30 min，DAB显色剂显色，光镜下观察。(2)免疫荧光法：同样是首先制作细胞爬片，使用波形蛋白(vimentin) 1∶100浓度4 ℃孵育过夜，后期使用647标记山羊抗兔IgG 1∶500浓度，37 ℃温箱30 min，PBS冲洗3次，DAPI染核10 min，荧光显微镜拍照，荧光染色后操作均需避光。

1.6 组织水平检测纤维化相关蛋白表达

对临床获取的EMs在位、异位以及正常人在位子宫内膜，做组织水平纤维化相关蛋白CTGF、α-SMA、Collagen α(1)的表达水平。具体方法：组织石蜡包埋切片，CTGF、α-SMA、Collagen α(1)一抗1∶100浓度4 ℃ 过夜，KPL山羊抗兔二抗1∶200 37 ℃温箱30 min，DAB显色剂显色，光镜下观察。

使用蛋白免疫印迹法检测细胞水平纤维化相关蛋白的表达，具体方法：将细胞收集进行蛋白提取BCA定量，制作等蛋白量点样液跑胶，不封闭。5%(体积分数)BSA-TBST稀释一抗1∶1 000在4 ℃孵育过夜，5%(体积分数)BSA-TBST稀释二抗，山羊抗兔IgG(H+L)HRP 1∶10 000，室温孵育 40 min。洗膜显影。

使用蛋白免疫印迹法检测得到组织及细胞水平纤维化相关蛋白的表达条带，图片扫描后，使用软件Gel Image ststem Ver. 4.00，对条带灰度进行分析，得到以β-actin为基线的纤维化相关蛋白表达结果比值，进一步对组织及细胞水平纤维化相关蛋白的表达水平做对比。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 EMs原代细胞培养结果

共收集培养12份内异症异位及在位子宫内膜组织，9份正常人子宫内膜组织，EMs在位间质细胞原代分离成功12例，成功率为100%。EMs异位组织分离培养12列成功11例，成功率为91.7%。正常人子宫内膜组织分离9例成功8例，成功率为88.9%。EMs异位组织分离培养失败的1例是因为操作时间过久引起细菌污染。正常人子宫内膜组织分离培养失败的1例是由于首次分离摸索条件时消化过度，细胞死亡。普通光学显微镜下细胞贴壁生长，形态呈三角梭形，细胞核圆形居中。3组细胞形态学无明显差异，培养结果见图1。

2.2 原代提取细胞波形蛋白(vimentin)鉴定结果

3组原代培养的间质细胞vimentin表达明显，改良后原代EMs间质细胞提取方法能够成功提取出间质细胞，详见图2。

2.3 EMs异位、在位及正常人在位子宫内膜组织中纤维化相关蛋白表达差异

EMs异位组织中纤维化相关蛋白CTGF、α-SMA、Collagen α(1)的表达较EMs在位及正常人子宫内膜明显增高，而EMs在位组织与正常人子宫内膜纤维化相关蛋白的表达无明显差异。普通免疫组织化学可见淡蓝色椭圆形为细胞核，棕色为相关蛋白的表达水平。可以看出子宫内膜异位组织中纤维化相关蛋白的表达明显高于子宫内膜在位及正常人子宫内膜组织(图3)。

图1 光学显微镜下观察原代细胞形态及大小Fig.1 Morphology of primary cells under light microscope (Scale bar=50 μm)

图2 免疫组织化学及免疫荧光检测间质细胞波形蛋白表达结果Fig.2 Detection of vimentin expression in mesenchymal cells by immunohistochemistry and immunofluorescence(Scale bar=25 μm)

HEnESCs：human normal endometrial stromal cells；HEcESCs：human ectopic endometrial stromal cells；HEuESCs：human eutopic endometrial stromal cells.

蛋白免疫印迹法再次检测EMs异位、在位及正常人在位子宫内膜组织中纤维化相关蛋白表达差异，子宫内膜异位组织中纤维化相关蛋白的表达明显高于子宫内膜在位及正常人子宫内膜组织(图4)。

EMs患者异位病灶组织中3种纤维化相关蛋白的表达水平与EMs在位子宫内膜及正常人子宫内膜组织的差异有统计学意义，而EMs在位子宫内膜与正常人子宫内膜组织中纤维化相关蛋白的表达差异无统计学意义(表1、2)。

2.4 间质细胞中纤维化相关蛋白的表达与组织水平存在一致性

2.4.1 经过蛋白免疫印迹定量检测

EMs患者异位病灶间质细胞纤维化相关蛋白的表达与EMs在位及正常人子宫内膜间质细胞纤维化相关蛋白的表达差异有统计学意义(P<0.05)，通过Bland-Altman方法分析组织及细胞水平纤维化相关蛋白差异一致性，组织与细胞水平纤维化相关蛋白的表达存在一致性(图5)。

2.4.2 统计分析组织水平

HEcESCs中纤维化相关蛋白的表达水平与HEuESCs及HEnESCs两组细胞中纤维化相关蛋白的表达水平，差异有统计学意义(P<0.05)。而HEuESCs与HEnESCs两种细胞种纤维化相关蛋白的表达差异无统计学意义(P>0.05)，详见表3、4。

3 讨论

EMs作为育龄期女性的常见病、多发病，其生物学特征至今仍不明确。多种发病学说中经血逆流学说较为经典并广为接受[3]。由于经血逆流普遍存在于在育龄期妇女，但只有少数发展为EMs。针对这一现象目前又有不同的观点，一种观点[9-10]认为EMs患者在位子宫内膜细胞的特性有关，逃脱了免疫监视和清除而得以在盆腔内种植。 另一种观点[11-12]认为是EMs患者免疫系统出现异常，无法清除正常的逆流经血。本实验通过改良EMs原代细胞培养方法培养子宫内膜间质细胞，简化了EMs原代培养的步骤，同时保证了较高培养成功率。本实验在EMs原代细胞培养的基础上检测3组细胞及相应组织中纤维化相关蛋白的表达。结果显示，EMs患者异位病灶组织及间质细胞CTGF、α-SMA、Collagen α(1)的表达明显高于EMs在位及正常人子宫内膜组织及间质细胞，而EMs在位内膜组织及间质细胞与正常人子宫内膜组织及间质细胞纤维化相关蛋白的表达水平差异无统计学意义。同时本研究发现EMs在位组织与细胞纤维化相关蛋白表达水平较EMs异位组织及细胞有较大差异，该结果提示EMs患者在位子宫内膜在异位到宫腔外前并没有表现出纤维化的特征，异位后的子宫内膜在异位部位各种条件的诱导下，发生纤维化，引起了慢性盆腔痛、女性不孕等一系列症状，因此异位后的子宫内膜在异位部位发生纤维化过程值得进一步探讨。关于EMs纤维化的具体分子学发生机制目前尚未明确，本课题组将继续对其分子水平的演变过程进行进一步研究。EMs原代细胞培养困难，分离培养过程尽可能满足以下几点 ：(1)取材：尽可能选择新鲜内膜异位囊肿，组织获取后冰盒转运，立刻送往实验室分离培养。(2)操作：首先取材操作过程中注意无菌原则。组织剪碎过程要尽可能迅速，操作时间延长将提高污染的风险。组织要尽可能剪碎，大块组织需要延长消化时间，增加消化酶对细胞的损伤。组织消化时间不宜过长，可适当增加消化次数。(3)培养：首次培养培养基内可加入5%(体积分数) 1×PS双抗减少污染。原代培养的EMs间质细胞传代培养6代内能稳定生长。本实验对以往的培养方法加以验证及改进，摸索出一种简单、实用的EMs原代细胞分离方法。改进后优点：(1)以往以胶原酶和DNaseⅠ混合消化方法，操作步骤繁多，操作时间长，增加了污染机会，本实验所有消化液一次性按比例混合，减少污染。(2)以往分离方法价格昂贵，加大了相关实验的经费支出，本实验采用0.25%(质量分数)Ⅳ型胶原酶-胰蛋白酶-EDTA混合液作为消化液，不使用DNA酶，大幅度降低操作成本。(3)本实验保持较高成功率，为后期EMs相关实验提供好的基础。本实验，证明了EMs异位病灶组织及间质细胞纤维化水平明显高于EMs在位及正常人子宫内膜。明确EMs异位病灶有明显的纤维化，异位病灶原代分离的间质细胞与组织水平纤维化相关蛋白的表达存在一致性。为后期EMs相关研究提供突破口及进一步设计实验提供基础。

图3 免疫组织化学检测子宫内膜在位、异位及正常子宫内膜组织水平纤维化相关蛋白CTGF，α-SMA 及Collagen α(1)的表达水平Fig.3 Expression levels of fibrosis-associated proteins CTGF，α-SMA and collagen1 in the eutopic，ectopic of EMs and normal endometrial tissues of the endometrium detected by immunohistochemistry(Scale bar=50 μm)CTGF：connective growth factor；α-SMA：α-smooth muscle actin;EMs：endometriosis.

图4 蛋白免疫印迹检测子宫内膜在位、异位及正常子宫内膜组织水平纤维化相关蛋白CTGF，α-SMA 及Collagen α(1)的表达水平Fig.4 Expression levels of fibrosis-associated proteins CTGF，α-SMA and Collagen α(1) in eutopic，ectopic of EMs and normal endometrial tissues of the endometrium by Western blottingCTGF：connective growth factor；α-SMA：α-smooth muscle actin;EMs：endometriosis.

ProteinEMsectopicEMseutopicControlF/HPCollagenα(1)/actin0.449±0.0580.264±0.0580.231±0.11510.8030.005α-SMA/actin0.546±0.1160.331±0.0970.310±0.07219.593<0.001CTGF/actin0.405±0.0940.231±0.0530.220±0.07911.3640.003 EMs:endometriosis;CTGF:connectivegrowthfactor;α-SMA:α-smoothmuscleactin.

表2 组织水平蛋白表达差异两两比较Tab.2 Protein expression differences in two pairs at the tissue level

图5 蛋白免疫印迹检测子宫内膜在位、异位及正常人子宫内膜细胞水平纤维化相关蛋白CTGF，α-SMA 及Collagen α(1)的表达水平Fig.5 Expression levels of fibrosis-related proteins CTGF，α-SMA and Collagen α(1)in eutopic，ectopic of EMs and normal endometrial cells detected by Western blotting

ProteinControlEMsectopicEMseutopicFPCollagenα(1)/actin0.226±0.0690.621±0.1080.293±0.12533.574<0.001α-SMA/actin0.300±0.1810.595±0.0490.286±0.14812.845<0.001CTGF/actin0.284±0.1210.470±0.0630.273±0.10310.1060.001 EMs:endometriosis;α-SMA:α-smoothmuscleactin;CTGF:connectivegrowthfactor.

表4 细胞水平蛋白表达差异两两比较Tab.4 Protein expression differences in two pairs at the cellular level