新抑癌基因GPD1在结肠癌细胞HCT-8中的作用及其预后潜力研究

闵 力 李恒存 郭庆东 王星宇 张澍田

(首都医科大学附属北京友谊医院消化分中心 国家消化系统疾病临床医学研究中心 消化疾病癌前病变北京市重点实验室 北京消化中心，北京 100050)

在全世界范围内，结直肠癌发病率排名第三，病死率排名第四，其中70%都是结肠癌[1]。近年来，我国的结肠癌发病率显著上升，可能与人民生活方式及饮食习惯的改变有关[2]。结肠癌的发病原因复杂，在分子水平上进行机制研究，尤其是探索新的分子标志物与治疗靶点，对于促进结肠癌诊疗，提高患者的预后具有重要意义[3-4]。

甘油-3-磷酸脱氢酶1(Glycerol-3-Phosphate Dehydrogenase 1，GPD1)基因位于染色体12q13.12上，是胞质蛋白GPD1的编码基因。GPD1催化磷酸二羟丙酮(dishychoxyactone phosphate, DHAP)与甘油-3-磷酸(glycerol-3-phosphate,G3P)/NAD+之间的可逆氧化还原反应，且GPD1与线粒体亚型GPD2一起发挥将还原当量从胞质转运到线粒体的作用[5]。GPD1被认为是连接碳水化合物和脂质代谢的关键因素，其活性异常可促进肥胖患者中三酰基甘油(triacylglycerol,TAG)合成的增加或减少[6]，在高三酰甘油血症、脂肪肝、肝纤维化、肝肿大和脂肪性肝炎中起着至关重要的作用[7]。Basel-Vanagaite等[8]报道了携带GPD1纯合子剪接突变(c.361-1G>C)的10名患者，表现为早发性肝肿大，肝脏脂肪变性和高三酰甘油血症，是第一个确定GPD1基因与人类疾病相关的研究。然而，GPD1与肿瘤发展的关系研究较少。Zhou等[9]首先报道，GPD1在乳腺癌中表达下调，与乳腺癌患者预后相关，且GPD1在乳腺癌中发挥抑制肿瘤增生/迁移和侵袭的作用。在结肠癌中，GPD1的表达情况与功能目前尚无相关研究。

在本研究中，笔者主要探索了GPD1在结肠癌细胞系HCT-8中的作用，同时明确了GPD1表达与结直肠癌患者预后的关系，并结合生物信息学分析揭示了GPD1在结肠癌中低表达可能与其编码基因高甲基化相关。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

胎牛血清(fetal calf serum， FBS)、Dulbecco’s modified eagle’s medium(DMEM)培养基、磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)、胰蛋白酶(Trypsin)(Gibco公司，美国)、MTS[3-(4,5-dimethylthiazol-2-ly)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide]细胞增生试剂盒(Amresco公司，美国)；Lipofectamin 3000(Invitrogen公司，美国)；GPD1抗体(sc-376219, Santa Cruz公司, 美国)；恒温CO2细胞培养箱(三洋公司，日本)；25 cm2Costar无菌细胞培养瓶、6孔细胞培养板(Corning公司，美国)；多功能酶标仪(MD公司，美国)；超纯水机(Millipore公司，美国)；GPD1 siRNA(吉玛公司，中国)

1.2 细胞培养与转染

HCT-8人结肠癌细胞购自美国标准培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)，在添加有10%(体积分数)FBS的DMEM培养基中培养，温度为37 ℃和5%(体积分数)CO2。应用Lipofectamine 3000试剂进行si-GPD1的转染，以Western blotting验证转染效率。GPD1 siRNA购自苏州吉玛有限公司。si-GPD1-1的序列为5′-CACUGGCAUAUCUCUUAUU-3′，si-GPD1-2序列为5′-GCAGCAUGAGAAUGUCAAA-3′。NC siRNA序列为5′-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3′。GPD1的qPCR检测引物为5′-CCAGGGACAACTCCTGAAAGA-3′(正向)与5′-TTGGCGAAGGCTATCATCTCC-3′(反向)。GAPDH的qPCR检测引物为5′-TGTGGGCATCAATGGATTTGG-3′(正向)与5′-ACACCATGTATTCCGGGTCAAT-3′(反向)。

1.3 MTS实验

将HCT-8细胞进行转染后，在96孔板的每个孔中接种1 000个细胞，共接种4板细胞。在0、24、48和72 h的时间点分别取出1板细胞并将MTS试剂加入孔中。在37 ℃下孵育2 h后，用酶标仪检测细胞活力。

1.4 集落形成实验

将转染处理后的HCT-8细胞消化后重悬并计数后，以1 000每孔的细胞浓度在6孔板中进行细胞接种，分为对照组(Normal control, NC)与GPD1干扰组，每组各设置3个复孔。细胞充分混匀后置于37 ℃培养箱进行培养，每2～3 d换液1次，培养至肉眼可见细胞集落时，进行细胞结晶紫染色并计数统计。

1.5 划痕实验

细胞转染后以5×105的细胞浓度均匀接种在6孔板中，培养至细胞汇合。使用无菌移液管尖端在每个孔中进行划痕处理。用无菌PBS进行洗涤以清除细胞碎片，然后在不含FBS的纯培养基中培养。在36 h的时间点，在每孔的相同位置拍摄记录迁移状态。

1.6 Transwell实验

细胞转染后用无血清培养基悬浮细胞，以2×105的细胞浓度均匀接种在24孔板中，迁移实验用Chamber为普通Chamber，侵袭实验用Chamber为特制的Matrigel Invasion Chamber，在下室加入800 μL 含10%(体积分数)胎牛血清的培养基，上室加入150 μL细胞悬液(无血清)，继续在孵箱培养24 h，用镊子小心取出Chamber，吸干上室液体，移到预先加入约800 μL甲醇的孔中，室温固定30 min后DAPI染色，观察计数。

1.7 生物信息分析

笔者从TCGA官方网站上下载了结直肠癌患者Level 3的mRNA表达数据，以及甲基化芯片数据，根据GPD1的表达中位数将患者分为GPD1高表达与低表达两组，从而比较这两组的生存差异及对应的GPD1甲基化水平差异，同时对全部病例GPD1的mRNA表达水平及其甲基化水平进行了相关性分析。

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 Western blotting验证si-GPD1的基因敲低效率

多种结肠癌细胞系及正常结肠上皮细胞系中GPD1的表达结果显示，不同细胞系之间GPD1表达水平差异有统计学意义，其中HCT-8细胞系中GPD1表达水平最高(图1A)。为验证si-GPD1的基因敲低效率，笔者以NC组及si-GPD1-1/si-GPD1-2转染48 h后的HCT-8细胞提取总蛋白进行Western blotting实验。结果显示，在转染处理后，与对照组相比，si-GPD1处理组GPD1蛋白表达量均明显下降，证明si-GPD1效果可靠，为后续功能学实验提供了保障(图1B)。

图1 GPD1在结肠癌细胞系HCT-8中的功能Fig.1 Functions of GPD1 in colon cancer cell HCT-8

A:GPD1 expression level in different colon cancer and noncancerous cell lines (reference cell: CCC-HIE-2，n=3);B: After si-GPD1-1/si-GPD1-2 treatment, GPD1 expression level in HCT-8 significantly decreased;CandD: After siRNA knock down ofGPD1, growth rate of HCT-8 was upregulated (n=3);E: After siRNA knock down ofGPD1, colony formation ability of HCT-8 was upregulated (n=3).**P<0.01,***P<0.001;GPD1:glycerol-3-phosphate dehydrogenase 1;NC:Normal control.

2.2 GPD1干扰后结肠癌细胞增生、集落形成能力增强

MTS实验与集落形成实验，结果显示，在GPD1基因敲低后，HCT-8细胞增生活力增强，3次重复实验统计结果显示差异有统计学意义(全部时间点重复测量数据方差分析P<0.001，72 h时间点t检验P<0.01)(图1C，D)；在集落形成实验中，与对照组相比，GPD1基因干扰组集落形成数量增多，且集落直径较大，差异有统计学意义(P<0.01)(图1E)。

2.3 GPD1干扰后HCT-8细胞迁移运动能力无明显变化

细胞划痕实验结果显示，在干扰GPD1基因表达后，HCT-8细胞的迁移能力差异无统计学意义(图2A)；Transwell迁移实验及侵袭实验验证结果也显示，GPD1敲低后HCT-8的迁移及侵袭能力均没有显著性变化(图2B、C)。

图2 GPD1对结肠癌细胞系HCT-8运动能力的影响Fig.2 Influence of GPD1 on motility of HCT-8 cells

A:After siRNA knock down ofGPD1, scratch healing ability of HCT-8 was unchanged (n=3);B: After siRNA knock down ofGPD1, transwell migration ability of HCT-8 was unchanged (n=3);C: After siRNA knock down ofGPD1, transwell invasion ability of HCT-8 was unchanged (n=3).GPD1:glycerol-3-phosphate dehydrogenase 1;NC:Normal control.

2.4 GPD1低表达是结直肠癌预后不良的独立风险因素

应用TCGA数据库进行生物信息学分析，结果显示，GPD1低表达的结直肠癌患者总存活率(χ2=4.1,P=0.040)及无病存活率(χ2=13.2,P<0.000 1)均明显低于GPD1高表达患者(图3A，B)。进一步纳入患者年龄、性别、肿瘤大小、TNM分期等临床因素，进行多因素COX模型分析结果显示，肿瘤的T分期、M分期，以及GPD1表达水平都是结直肠癌预后的独立风险因素(Wald testχ2=44.0,P<0.001，表1)。

表1 GPD1表达水平是结直肠癌预后的独立风险因素Tab.1 GPD1 expression level is an independent predictor of prognosis of CRC patients

GPD1:glycerol-3-phosphate dehydrogenase 1;DFS: disease free survival;HR: hazard ratio;CI: confidence interval；CRC：colorectal cancer.

2.5 结直肠癌中GPD1的低表达可能与其编码基因的高甲基化相关

为探究结直肠癌组织中GPD1低表达是否与DNA甲基化相关，笔者以TCGA数据库进行了系统分析，结果显示，GPD1甲基化水平高的肿瘤中GPD1的表达水平显著较低(图3C)，Pearson相关性分析显示，GPD1的表达水平与其甲基化水平呈负相关(r=-0.253，P<0.001)(图3D)。

图3 GPD1表达水平与结直肠癌患者预后相关，结直肠癌中GPD1低表达与编码基因高甲基化相关Fig.3 GPD1 expression level is associated with prognosis of CRC patients, which is also negatively correlated with GPD1 gene methylation level

A: Patients with a lowerGPD1 showed a shorter overall survival;B: Patients with a lowerGPD1 showed a shorter disease free survival;C: DifferentGPD1 expression level in differentGPD1 methylation status;D: mRNA level ofGPD1 was negatively correlated withGPD1 gene methylation level;CRC:colorectal cancer；GPD1:glycerol-3-phosphate dehydrogenase 1.

3 讨论

GPD1在机体代谢反应中发挥重要作用，前期研究[10]报道GPD1催化葡萄糖来源的DHAP与甘油-3-磷酸(glycerol-3-phosphate，G3P)之间的转化，后者参与生成三酰甘油，而GPD1基因突变被报道与多种代谢性疾病相关[7]。Zhou等[9]报道GPD1在乳腺癌中发挥抑癌作用，且与乳腺癌患者预后相关。然而，GPD1在结直肠癌发生发展中的功能研究仍为空白。

在本研究中，笔者应用HCT-8结肠癌细胞系敲低GPD1基因表达进行功能实验，结果表明，干扰GPD1后，结肠癌细胞HCT-8的增生活力与集落形成能力显著提高，与GPD1在乳腺癌中的作用相一致[9]，而细胞迁移能力无显著变化。此外，在本研究中笔者首先明确了GPD1表达水平与结直肠癌患者临床预后的关系。通过对TCGA数据库的生物信息学分析，笔者发现GPD1低表达结直肠癌患者的总存活率及无病存活率更低，且GPD1低表达是结直肠癌患者不良预后的独立预测因素，这与笔者细胞功能学研究的结果是相一致的，均证明GPD1在结直肠癌中发挥抑癌作用。有研究[11]显示DNA甲基化在不可逆启动子沉默/调控基因表达中发挥重要作用。在GPD1的表达调控方面，笔者首次探索了GPD1在结直肠癌中低表达与其编码基因甲基化之间的关系，数据分析结果显示，GPD1低表达可能是由其编码基因高甲基化引起的。

有文献[12]报道GPD1在乳腺癌中发挥抑癌作用，且其抑癌作用与细胞增生有关，与本研究结果相一致。恶性肿瘤因其不受控制的细胞增生需要大量的能量支持[13]。而癌细胞表现出相对于正常分化细胞不同的细胞代谢方式[14]，过去十年的进展表明，肿瘤代谢改变的几个特征是由各种致癌基因或肿瘤抑制因子的变化诱导的[15-17]。GPD1编码蛋白甘油-3-磷酸脱氢酶1参与碳水化合物与脂质之间的代谢转化，Basel-Vanagaite等[8]报道了携带GPD1纯合子剪接突变导致高三酰甘油血症，而高三酰甘油血症是结直肠癌的高危因素[18]。因此，笔者认为，GPD1蛋白缺失很可能通过干扰碳水化合物与脂质之间的正常代谢而促进结肠癌的发生发展。但其具体作用机制还需要进一步深入研究来明确。

综上所述，GPD1在结肠癌中发挥抑制细胞增生与集落形成的作用，且GPD1低表达是结直肠癌患者不良预后的独立预测因素。对GPD1的研究对发现结肠癌潜在治疗靶点和预后评估指标具有重大的临床意义，但其具体作用机制仍需要进一步探索。