姜黄素对KOA模型大鼠关节软骨Wnt信号通路的影响

舒子震 吴向阳(通讯作者)

（1湖南中医药大学 湖南 长沙 410000）

（2湖南省第二人民医院 湖南 长沙 410000）

1.材料与方法

1.1 动物分组及造模

动物适应性饲养1周后进行编号并称重，将30只SD大鼠随机分为对空白组、模型组、对照组，每组10只。除空白组外，其余2组均采用改良Hulth法造模[1]，离断内侧副韧带，完整切除内侧半月板1/3，避免损伤关节软骨面。术后第2天开始驱赶动物，30min/d，连续4周。姜黄素溶于10%的DMSO溶液制备成5%的溶液，术后4周开始，治疗组予以每天100mg/kg姜黄素灌胃，模型组予以等量生理盐水灌胃，连续4周。

1.2 大体形态观察评定

过量水合氯醛处死各组大鼠，碘伏消毒左后肢，暴露整个膝关节腔，观察各组模型动物左侧膝关节情况，参照Mankin’s评分标准予以形态学评分，见表1。

1.3 组织病理性检测

将各组OA模型大鼠股骨髁标本切片进行HE染色及甲苯胺蓝染色，于光镜下观察软骨面是否平整，有无裂隙，细胞是否规则分布、排列，潮线是否完整；软骨及基质甲苯胺蓝失染程度，参照Mankin’s评分标准进行病理学评分，见表1。

表1 病理Mankin’s评分标准

1.4 ELISA检测

精密天平称取软骨组织，以1g:10mL加入磷酸盐缓冲液（PBS），冰上迅速研磨粉碎，充分震荡后12000 r/min离心，取上清液备用。根据大鼠β-连环蛋白(β-catenin)酶联免疫分析(ELISA) 试剂盒说明书进行检测。

1.5 统计学方法

2.结果

2.1 Mankin’s评分结果

2.1.1 大体标本评分结果 观察各组SD大鼠左膝关节。空白组关节腔内均未见明显积液，滑膜无水肿及充血，软骨表面光滑平整基本无裂隙，软骨透明呈蓝白色；模型组中均伴有明显关节腔积液，滑膜组织可见明显充血水肿，软骨呈灰黄色，无明显光泽感，表面较粗糙，并可见出血糜烂；治疗组中，关节腔积液较模型组少，滑膜组织可见充血水肿，部分标本软骨面相对不平整，光泽暗淡，颜色稍黄，少见出血及糜烂。

大体形态比较：将空白组与模型组，模型组与经姜黄素灌胃治疗4周后的治疗组大鼠参照Mankin’s评分进行形态学比较，结果有显著性差异（P＜0.05），见表2。

2.1.2 光镜下评分结果 在光镜下分别观察3组标本病理切片，空白组镜下可见基质均匀着色，软骨细胞圆润，排列整齐，软骨层较厚，潮线完整，甲苯胺蓝染色基质染色均匀；模型组中，软骨基质着色明显变淡，细胞体积及细胞核增大，形态不规则，多见簇集细胞团，软骨层厚度显著变薄，可见有裂隙，甚至软骨存在部分软骨缺损，部分出现钙化层；潮线完整性较空白组显著紊乱，部分可见血管入侵；甲苯胺蓝染色基质失染严重。治疗组标本切片镜下表现介于空白组与模型组之间，少见簇集细胞团，软骨层厚度较正常组变薄，潮线紊乱。

软骨细胞、潮线完整性、甲苯胺蓝染色比较：空白组与模型组、治疗组与模型组进行比较，两组差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 各组标本Mankin’s评分结果（，分）

表2 各组标本Mankin’s评分结果（，分）

组别 例数 大体 HE软骨 HE潮线 甲苯胺蓝空白组 10 0 0 0 0.1±0.32模型组 10 3.2±0.92 2.4±0.52 1.6±0.52 2.7±0.67治疗组 10 1.7±0.82 1.3±0.48 1.1±0.32 1.2±0.42

2.2 ELIASA检测结果

空白组软骨组织ß-catenin蛋白含量显著低于模型组及治疗组（P＜0.05），模型组软骨组织中ß-catenin蛋白含量显著高于治疗组（P＜0.05），见表3。

表3 各组标本软骨组织中ß-catenin蛋白含量（）

表3 各组标本软骨组织中ß-catenin蛋白含量（）

组别 空白组 模型组 治疗组例数 10 10 10含量 2.41±0.83 10.49±0.53 5.01±0.75

3.讨论

骨关节炎是一种常见的退行性关节疾病，目前认为，OA是在生物力学因素的作用下，破坏了关节软骨细胞、软骨基质以及软骨下骨的降解和修复的动态平衡的结果[1]。现已知多种细胞类型、细胞因子、信号通路等参与到了疾病过程中。实验采用改良Hulth法以改变相应关节的正常力线来建立动物模型，符合KOA发病的自然规律，更加贴合临床实际[2-4]。本实验中空白组模型动物膝关节标本及切片评分远低于模型组，形态学及病理学观察模型组动物膝关节软骨改变符合KOA病理改变[5]。模型组与治疗组实验动物的关节软骨均不平整，其中治疗组评分明显优于模型组；光镜下可见治疗组细胞核无明显增大表现，形态较模型组规则，少见簇集细胞团，基质轻度失染，各项评分均低于模型组。表明治疗组SD大鼠的膝关节软骨损伤程度相较模型组明显减轻，这一结果与宋永周[6]等人以及陈琼[7]等人进行的体外软骨细胞实验相符合，提示姜黄素通过保护KOA大鼠的膝关节软骨而治疗OA。β-catenin作为Wnt信号通路中的一个重要组成部分，是整个经典信号通路的关键[8-9]。越来越多的研究表明β-catenin的含量在退变的软骨细胞中表达上调，并由此激活Wnt信号通路参与到软骨的损伤过程中。姜黄素是一种具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎等多种药理作用的植物多酚[10]。可直接作用于细胞内相关蛋白及基因，通过调节细胞间信号通路中的各类蛋白或细胞因子而发挥其强大的药理作用。宋魏[11]和张宋欧[12]等研究表明姜黄素可通过调节Wnt信号通路参发挥抗肿瘤、抗炎等作用。本实验模型组大鼠关节软骨组织标本中的β-catenin蛋白含量明显高于空白组及治疗组，表明KOA关节软骨中β-catenin蛋白表达水平上调，姜黄素可通过下调其表达水平而保护关节炎关节软骨。治疗组中光镜下可见软骨基质丢失较模型组少，考虑姜黄素可能通过下调β-catenin蛋白表达，减少基质降解而发挥其保护作用。