大脑中动脉线栓法复制卒中后创伤后应激障碍样大鼠模型的建立*

李龙梅，毛萌，邓志云，宋慧荣，罗亚敏，李佳林，武佳杰，任小巧

(北京中医药大学，北京 100029)

脑卒中是一种具有高患病率、高发病率、高死亡率和高致残率特点的“四高”疾病，是全球范围内第二大常见死亡原因和第三大常见致残原因[1]。脑卒中不仅造成了躯体上的残障，而且对患者的精神、心理、社会参与能力也产生了不容忽视的影响[2]。此病属于突发性、灾难性疾病，患者多无思想准备，通常会给患者带来较大的心理刺激，可被认为是严重的“脑创伤”事件。部分患者在脑卒中后除神经功能障碍症状外，还通常出现对脑卒中过程中情境的重复性体验、情感麻木、回避、警觉性增高以及强烈烦躁不安和认知障碍等自主神经系统症状，即卒中后出现的创伤后应激障碍[3]。随着脑卒中的高发，卒中后创伤后应激障碍(post-traumatic stress disorder，PTSD)也不容忽视，此类患者如不能得到及时有效的治疗，不仅躯体及认知功能的恢复会受到限制，而且存在病情恶化甚至死亡的风险。近年来国内对卒中后PTSD的关注度日益增高，但其实验研究仍缺乏公认的动物模型，所以建立一种能有效模拟人类卒中后PTSD发生发展过程的动物模型对深入研究该病的病因、发病机制和治疗等具有积极意义。本研究采用大脑中动脉线栓法制备大鼠脑卒中模型，探索其是否具有PTSD状态并评价，为卒中后PTSD疾病模型的开发和利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组 成年健康雄性Wistar大鼠45只，体质量(220±10) g，SPF级，由斯贝福(北京)生物科技有限公司提供，动物生产许可证号：SCXK(京)2016-0002。实验在北京中医药大学动物房中进行，室内温度： 23～25 ℃，相对湿度：(55 ±10) %，40 W日光灯照射，维持12 h光照和12 h黑暗的昼夜。实验前动物适应性饲养3 d，以全价颗粒饲料喂养，自由饮水。造模前将大鼠随机分为3组，模型对照组、假手术组、单次延长应激(single-prolonged stress，SPS)组。实验过程中对动物的处理均遵循动物实验的3R原则。

1.2实验试剂 75%乙醇购自安徽太和县光明酒精分装厂(批号：160606)；无水乙醚购自北京化工厂(批号： 20170417)。Trizol购自Invitrogen公司，反转录试剂盒购自Fermentas公司，Power SYBR green购自Invitrogen公司，引物由生工生物工程股份有限公司设计并合成。

1.3主要仪器 圆桶状透明塑料大鼠固定器：长25 cm，外径7 cm，内径5 cm，由北京中医药大学方剂学教研室提供；水箱：底65 cm×100 cm、高80 cm 的立方形红色塑料水箱；行为学观察及自动分析系统：Nodule公司生产，包括计算机、摄像监控系统、Observior及Ethevision行为学分析软件。

1.4造模

1.4.1采用脑中动脉线栓法复制局灶性脑缺血模型大鼠 参照LONGA等[4]报道的线栓法建立脑缺血大鼠模型。采用10%水合氯醛(400 g·kg-1)对模型对照组大鼠进行腹腔注射，麻醉后取仰卧位固定于手术台上，消毒备皮，经颈正中切口后钝性分离右侧颈总动脉(common carotid artery，CCA)、颈内动脉(internal carotid artery，ICA)及颈外动脉(external carotid artery，ECA)，结扎CCA和ECA，在CCA近分叉处剪一小口，经ECA向ICA插入线栓，阻断大脑中动脉血供，缺血90 min后拔除线栓，成功制备大脑中动脉闭塞再灌注损伤模型。假手术组除不插入线栓外，其他处理同上。术后6 h，根据Longa的6点评分法对模型对照组大鼠进行神经症状学评分，1～4分的纳入本研究。

1.4.2复制PTSD大鼠模型 对SPS组大鼠采用国际通用的单次延长应激方法建立PTSD模型[5]。处理步骤如下：紧密束缚2 h，随后强迫游泳20 min(水深40 cm，水温25 ℃)，经过15 min的自然恢复，密闭容器内乙醚麻醉至意识丧失，待其意识恢复后把动物放回鼠笼静养。

1.5行为学检测 于造模后第 7天及第14天两个时点进行行为学测试，测试均在安静环境中进行，开始前让大鼠在测试间适应1 h。

1.5.1高架十字迷宫实验 实验装置由两条相对开放臂(50 cm×10 cm)和两条相对闭合臂(50 cm×50 cm×10 cm)及中央区(10 cm×10 cm)连接而成，距离地面50 cm将大鼠从中央格面向闭合臂放入，释放后开始观察并记录5 min内大鼠的活动情况。5 min后取出大鼠，用乙醇擦拭设备以清除大鼠残留的大、小便及气味等信息。统计以下数据：开放臂进入次数、开放臂进入时间、闭合臂进入次数、闭合臂进入时间，评判者由非实验人员完成以保证结果客观。进臂总次数=开放臂进入次数+闭合臂进入次数；开放臂进入次数比(%)= 开放臂进入次数/(开放臂进入次数+闭合臂进入次数)×100%；开放臂进入时间比(%)= 开放臂进入时间/(开放臂进入时间+闭合臂进入时间)×100%，同理计算闭合臂进入次数比与进入时间比。

1.5.2社交趋避实验 社交趋避测试箱：敞口实验箱(100 cm×100 cm×40 cm)，黑色内壁。黑箱1为侧拉门实验箱(25 cm×25 cm×25 cm)，黑色不透光。黑箱2(25 cm×25 cm×25 cm)的箱一侧壁为铁丝网格，可通过网格观察到外界事物，其他侧壁均为黑色不透光侧壁。在实验箱内的一侧中间贴壁放入黑箱1，在其对面一侧中间贴壁放入装有社交目标大鼠的黑箱2，黑箱2的前、左、右三侧20 cm区域定义为社交区域。测试开始前先将动物放入黑箱1中适应2 min，然后打开挡板，测试5 min，观察并记录大鼠走出黑箱1的潜伏期、社交区进入次数、社交区域进入时间、直立次数。测试后拿出动物，乙醇擦拭实验箱和黑盒。

1.6荧光定量PCR 14 d行为学结束后，将大鼠麻醉后断头取脑，在冰盘上迅速分离右侧海马组织，置于洁净的EP管中，置于液氮中迅速冷冻后置于-80 ℃冰箱中备用。用Trizol试剂提取海马组织的RNA，反转录。PCR反应体系为20 μL：SYBR green 10 μL、上游、下游引物(10 μm)各0.4 μL，cDNA为反转录原液(20 μg RNA)稀释后2 μL、ddH2O 7.6 μL。引物序列(5'→3')：GAD67正义链AATACTACCAACCTGC-GTCCTACAAC，GAD67反义链：GACGACTCTTCTCTT-CCAGGCTATTG；GAD65正义链：TGCGAGTTCTGG-AAGACAATGAAGAG，GAD65反义链：ACCATGCGG-AAGAAGTTGACCTTATC；GLT1正义链：GGGTGCC-AACAATATGCCCA，GLT1反义链：GGTTCTTCCCC-AGCTTGTCG。PCR反应条件如下： 95 ℃，10 min，95 ℃，5 s，60 ℃，30 s(读取荧光数值)，共40个循环。熔解曲线： 扩增循环结束后，95 ℃，15 s，60 ℃(读取荧光数值)，1 min，然后从60 ℃至95 ℃ ，每增加 0.3 ℃，读取一次吸光值，最后95 ℃，15 s。PCR结果按2-△Ct，并进行统计学分析。

2 结果

2.1社交趋避实验结果 与假手术组比较，模型对照组大鼠潜伏期明显延长(χ2=22.50，P<0.01)、社交区进入时间明显缩短(χ2=21.50，P<0.01)、站立次数明显减少(χ2=17.20，P<0.01)；SPS组大鼠潜伏期延长(χ2=12.34，P<0.05)、社交区进入时间明显缩短(χ2=18.07，P<0.01)、直立次数减少(χ2=13.18，P<0.05)。14 d时模型对照组与SPS组各指标变化趋势同7 d，均差异有统计学意义(P<0.01)。模型对照组与SPS组比较，除了站立次数两组差异明显(P<0.01)外，其他各指标数据相近，7和14 d时均差异无统计学意义(P>0.05)。见表1，2。

2.2高架十字迷宫结果 与假手术组比较，模型对照组大鼠开放壁进入次数比减少(χ2=9.68，P<0.05)、开放壁进入时间比减少(χ2=11.23，P<0.05)、进臂总次数差异不明显(χ2=6.43，P>0.05)；SPS组大鼠开放壁进入次数比减少(χ2=10.24，P<0.05)、开放壁进入时间比减少(χ2=11.62，P<0.05)，进臂总次数差异不明显(χ2=5.59，P>0.05)。7 d时，与假手术组比较，模型对照组与SPS组各指标差异无统计学意义，但变化趋势同14 d。模型对照组与SPS组比较，7和14 d时各指标数据相近，均差异无统计学意义(P>0.05)。见表3，4。

表1 3组大鼠7 d社交趋避实验行为学指标比较

Tab.1Comparisonoftheparametersofsocialapproach-avoidancetestat7damongthreegroupsofrats

组别潜伏期社交区进入时间s社交区进入站立次假手术组151.66±14.6134.01±6.802.13±1.253.40±1.50模型对照组205.04±20.99∗17.93±2.98∗11.10±0.571.00±0.67∗1SPS组177.43±15.96∗29.87±2.73∗11.36±0.631.79±0.97∗1∗3χ224.1427.5311.0223.79

与假手术组比较，*1P<0.01，*2P<0.05；与模型对照组比较，*3P<0.01

Compared with sham operation group，*1P<0.01，*2P<0.05；compared with model control group，*3P<0.01

表2 3组大鼠14 d社交趋避实验行为学指标比较

Tab.2Comparisonoftheparametersofsocialapproach-avoidancetestat14damongthreegroupsofrats

组别潜伏期社交区进入时间s社交区进入站立次假手术组95.51±8.7836.26±8.572.60±0.703.20±0.63模型对照组189.76±15.75∗17.90±4.54∗10.90±0.57∗10.50±0.53∗1SPS组173.53±14.93∗112.50±6.05∗11.11±0.66∗11.32±1.53∗1∗2χ224.5724.1222.6727.85

与假手术组比较，*1P<0.01；与模型对照组比较，*2P<0.01

Compared with sham operation group，*1P<0.01；compared with model control group，*2P<0.01

表3 3组大鼠7 d高架十字迷宫实验行为学指标比较

Tab.3Comparisonoftheparametersofelevatedplusmazetestat7damongthreegroupsofrats

组别开放臂进入次数比/%进入时间比/%进臂总次数/次假手术组0.36±0.150.11±0.118.14±5.46模型对照组0.18±0.23∗10.03±0.05∗13.42±2.71SPS组0.21±0.19∗10.04±0.06∗15.64±4.13χ22.944.8826.00

与假手术组比较，*1P<0.05

Compared with sham operation group，*1P<0.05

表4 3组大鼠14 d 高架十字迷宫实验行为学指标比较

Tab.4Comparisonoftheparametersofelevatedplusmazetestat14damongthreegroupsofrats

组别开放臂进入次数比/%进入时间比/%进臂总次数/次假手术组0.55±0.230.14±0.875.56±2.07模型对照组0.29±0.22∗10.04±0.03∗13.60±1.84SPS组0.27±0.25∗10.04±0.04∗13.79±1.58χ27.269.3914.67

与假手术组比较，*1P<0.05

Compared with sham operation group，*1P<0.05

2.3荧光定量PCR结果 与假手术组比较，模型对照组大鼠内GAD67(χ2=13.93，P<0.05)、GAD65(χ2=21.93，P<0.01)、GLT1(χ2=8.58，P<0.05)的基因表达均减少；SPS组大鼠海马内GAD65(χ2=20.93，P<0.01)、GLT1(χ2=19.75，P<0.01)，GAD67有减少趋势。见表5。

表5 3组大鼠14 d海马内目的基因mRNA表达情况比较

Tab.5ComparisonofthemRNAexpressionoftargetgenesinhippocampusat14damongthreegroupsofrats

组别GAD67GAD65GLT1假手术组1.03±0.271.04±0.291.08±0.36模型对照组0.68±0.25∗10.60±0.13∗20.79±0.24∗1SPS组0.87±0.36∗30.63±0.16∗20.41±0.17∗2∗3χ28.923.4426.12

与假手术组比较，*1P<0.05，*2P<0.01；与模型对照组比较，*3P<0.05

Compared with sham operation group，*1P<0.05，*2P<0.01；compared with model control group，*3P<0.05

3 讨论

脑卒中后个体的生理及心理受到了伤害，加之手术、社会关系改变易引发PTSD，有些患者会带病多年且不能完全恢复[6-7]，造成了一定的医疗和社会负担。目前尚无对PTSD的各组症状均能产生满意疗效的药物，因此开展对卒中后PTSD的研究对于了解其发病机制和寻找干预措施具有重要意义。卒中后PTSD在国内尚未引起足够的重视，鲜见对其模型探索的研究，而效度良好的动物模型是开展实验研究的基础，所以卒中后PTSD动物模型的建立迫在眉睫。PTSD-SPS模型是2005年在日本召开的“基础和临床的研究进展”会议中确定的，它通过束缚、强迫游泳和乙醚麻醉分别对动物的心理、生理及内分泌造成应激，可模拟PTSD患者的焦虑反应、高度警觉性以及神经内分泌改变，且所导致的焦虑、抑郁等可通过药物改善，重复性好，成为目前国际公认的PTSD动物模型之一[8-10]。因其具有可靠的表观、结构和预测效度，故可作为本研究中以大脑中动脉线栓法(middle cerebral artery occlusion，MCAO)造模是否出现PTSD状态的良好对照。PTSD患者通常会出现认知及心境方面的消极改变，存在着情感麻木或回避现象，具体表现可有对陌生的人或事物兴趣降低、与外界疏远隔离、交流减少等，所以社会能力尤其是社交能力在PTSD动物模型的行为学评价中尤为重要[11]。社交趋避实验是一种评价啮齿类动物社交行为的有效方法，实验中受试鼠对刺激鼠的接近或逃避行为能较好的反应大鼠的社交能力与抑郁状态，通过受试鼠第一次走出黑箱的时间、走进刺激鼠所在社交区域的时间及次数等来描述动物的社会偏好行为[12]。本实验中假手术组大鼠在较短时间内就从保护性黑箱中爬出来并进行探索，多次进入陌生同类所在区域并与其交流，而模型对照组和SPS大鼠与假手术组大鼠比较，第一次走出保护性黑箱的时间都延长，靠近社交区的时间和次数也都减少，且有较高的防御性，不愿与同类交流，可见模型对照组和SPS组大鼠对外界表现出一定的回避状态，对陌生同类的兴趣和交流欲望减少，提示这两组大鼠的社交回避趋势明显。PTSD患者的恐惧、回避以及警觉性增高属于人类的焦虑反应，可出现对创伤有关的刺激产生恐惧反应，甚至对无关的低刺激表现出高警觉状态[13]。高架十字迷宫实验是测试动物焦虑及回避症状的有效实验方法，通过利用啮齿类动物在选择探索新异环境还是回避高悬开放臂时产生的矛盾行为来反应其焦虑状态。本研究中高架十字迷宫实验结果显示，将模型对照组和SPS组大鼠至于中央区后，大鼠很快逃离到闭合臂中，很少去开放壁，且在开放壁的停留时间短暂；而假手术组大鼠对开放臂有较强的探究欲望，会在开放壁停留较多时间。此现象提示模型对照组和SPS组的大鼠探究天性和对外界的好奇心理减弱，焦虑反应较假手术组增强。7 d时SPS组大鼠的焦虑表现与假手术组差异不明显，而在14 d时出现明显差异，验证了SEROVA等[14]发现的SPS可导致延迟性焦虑反应和警觉度增高的现象。

PTSD的发生与中枢神经系统中的兴奋性神经递质谷氨酸(glutamate，Glu)与抑制性神经递质γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)的平衡失调密切相关，同时与负责空间学习记忆的重要脑区海马的损伤有关。Glu与PTSD发生过程中记忆的形成关系紧密，创伤事件后Glu水平的升高可以导致创伤记忆的编码和巩固，且高含量的Glu也可导致海马结构的损伤[15]。而GABA可以调节机体面对应激时的多种生理反应[16]，同时可以防止神经系统的过度激活及Glu的过度释放[17]。在Glu与GABA的代谢过程中，Glu可被星形胶质细胞膜上的谷氨酸转运体摄取到胞内而消除神经兴奋毒性，也可经谷氨酸脱羧酶(GAD) 脱羧后生成能拮抗Glu神经兴奋毒性的GABA。90%以上的谷氨酸是由谷氨酸转运体1(GLT1)摄取和转运的[18]，合成GABA的两种同工酶(GAD65和GAD67)的分布与GABA能神经元的分布基本一致[19]，故通过测定GLT1和GAD的活性可推测Glu与GABA的含量变化。本实验中，14 d后模型对照组与SPS大鼠海马内GLT1 、GAD65和GAD67的基因表达均减少，表明海马内星形胶质细胞摄取Glu的能力减弱且合成GABA的能力受到抑制，因此推测模型对照组与SPS组大鼠海马内Glu含量增多而GABA含量减少。增多的Glu兴奋毒性增加，且GABA的含量减少使其对神经系统的抑制作用及对Glu的拮抗减弱，更加剧了Glu与GABA的失衡状态。研究显示Glu与GABA的失衡状态可能是PTSD中应激高唤醒症状产生与维持的重要原因[20]。这与本实验中模型对照组大鼠出现高警觉状态的表现相符。行为学实验中模型对照组大鼠对陌生环境产生恐惧，回避同类，回避交流，对低危险的环境和事物保持高警觉，其表现与SPS造成的PTSD大鼠行为类似，同时与高杰等[21-22]先前对PTSD大鼠的研究结果相近。PCR实验结果可推测各组大鼠行为学表现的差异可能与其海马内Glu和GABA的含量变化有关，Glu增多、GABA减少的失衡状态可导致大鼠焦虑反应增强、恐怖记忆加深从而出现回避和高警觉状态等表现。由此可见，MCAO方法对大鼠造成了刺激并使其出现了应激反应，成功模拟了PTSD 状态的恐惧反应、警觉性增高、逃避行为、环境适应能力下降等。

综上所述，MCAO方法造成了一定程度的PTSD状态，其在社交趋避和高架十字迷宫实验中的行为学表现和海马内Glu与GABA的失衡状态与SPS造成的PTSD大鼠无明显差异。成功的动物模型需要有良好的表面效度、结构效度和预测效度，对于卒中后PTSD的动物模型来说，MCAO方法模拟了脑卒中脑缺血-再灌注的过程，且造模后出现了与SPS大鼠类似的应激障碍，故可以认为MCAO方法作为卒中后PTSD的动物模型有一定的表面效度和结构效度。至于此模型的预测效度以及造成的PTSD状态在神经生理学上是否与SPS大鼠也有一致性等问题还有待于后续的深入研究。