去势对白来航母鸡垂体和肾上腺的影响

邵 凡，李红伟，段金琳，李俊英，吴常信*

（1.中国农业大学动物科学技术学院，北京 100193；2.惠州学院生命科学学院，广东惠州 516007）

性激素是维持动物性功能和第二性征的物质，同时在参与机体蛋白质、糖类、脂质代谢中起到重要作用。在雌性动物体内，卵巢在垂体释放的促性腺激素调控下，合成和分泌以雌二醇为主的雌激素、孕激素以及少量雄激素。除了卵巢外，肾上腺是雌性动物合成雄激素的另一个主要器官。摘除雌性动物的卵巢，即去势后，紊乱的性激素水平负反馈调节垂体，改变垂体分泌激素的水平，或直接作用于其他靶器官，共同引起机体表型变化。

雌激素应答基因GREB1 是雌激素受体调控通路中的一个关键的调控因子[1]，在参与哺乳动物乳腺癌的形成和细胞分化过程中起到重要作用[2]。有关GREB1 基因在调控动物其他发育过程中的作用鲜有报道，仅Li 等[3]研究发现GREB1 与斑马鱼的垂体发育有关。基于此，本研究选择白来航母鸡为实验材料，以去势母鸡雄性化为表型，研究去势对母鸡垂体和肾上腺发育的影响，并将GREB1 作为垂体发育候选基因，检测去势母鸡垂体GREB1 mRNA 水平相对表达量，旨在为进一步研究性腺对下丘脑-垂体-肾上腺轴的功能影响提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 本研究中采用的白来航母鸡来自于中国农业大学家禽遗传资源与育种试验基地。实验组为 6 只于 9 周龄摘除卵巢的白来航母鸡，对照组为 6只未摘除卵巢的同日龄母鸡。饲养至97 周龄时屠宰，测量冠高、距长、肾上腺重和垂体重，并将垂体组织保存于液氮中。

1.2 血清雌二醇和睾酮浓度测定 上午静脉采血。采血前限饲12 h，每只鸡采 2 份血样，放置于4℃分离血清，测量血清中性激素浓度，并计算 2 份样品的平均值作为最终激素浓度。血清激素浓度测定由北京华英生物技术研究所采用 γ-911 全自动放免计数仪、E2-17β（HY-10029）放免试剂盒以及睾酮（HY-10027）放免试剂盒完成。

1.3 垂体总RNA 提取及定量引物 试剂盒提取垂体总RNA。将垂体组织放入1 mL TRIzol 中匀浆裂解，离心取上清，加入200 μL 氯仿混匀，室温放置3 min。离心取上清，加入300 μL 无水乙醇，混匀，将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱 CR3 中，之后的步骤同动物组织总RNA 提取试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司，DP431）。

利用Primer Premier 5.0 设计GREB1 定量引物，引物序列F：5'- ACAAGACCATCGGTGTTAGGC-3'，R：5'-GGTGACCAACCTTTATGGCGT-3'。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 统计分析 利用Prism7 软件对数据进行分析、作图。2 组间差异采用 t-test 分析，结果表示为平均值±标准误。

2 结 果

2.1 去势对母鸡血清雌二醇和睾酮浓度的影响 由表1 可知，去势母鸡血清雌二醇浓度低于未去势母鸡（P＜0.01），血清睾酮浓度与未去势组无显著差异。

表1 去势对母鸡血清激素浓度的影响

2.2 去势对母鸡冠高、距长及肾上腺、垂体重量的影响表2 显示，去势母鸡的冠高（P＜0.01）、距长（P＜0.01）和垂体重（P＜0.05）高于未去势母鸡，去势母鸡的肾上腺重低于未去势母鸡（P＜0.01）。

表2 去势对母鸡第二性征及垂体、肾上腺重的影响

2.3 垂体GREB1 mRNA 相对表达量 图1 显示，去势母鸡垂体GREB1 相对表达量低于未去势母鸡（P＜0.05）。

图1 去势对母鸡垂体GREB1 mRNA 相对表达量

3 讨 论

雌性动物的卵巢除了产生卵细胞外，还可分泌以雌二醇为主的雌激素、孕激素以及少量雄激素。本实验中，白来航母鸡摘除卵巢后，血清雌二醇浓度显著降低，与Terada 等[4]对白来航母鸡去势的研究结果一致。Valdez等[5]摘除2 个近交系母鸡的卵巢并测定54 周龄时血清性激素水平的研究显示，卵巢摘除后，血清性激素水平的变化在2 个近交系中有相同趋势，均为去势母鸡雌激素浓度显著降低，雄激素浓度升高，但未达到显著水平，与本实验中白来航去势母鸡的血清雌二醇、睾酮浓度变化趋势一致。卵巢摘除后，母鸡血清雌激素浓度减少，雄激素浓度增加，使母鸡向雄性化发育。在雌性动物体内，除了卵巢外，肾上腺贡献了机体30%～50%的雄激素[6]。本实验结果表明，去势可降低母鸡肾上腺重，这一结果与Kitay[7]对雌性大鼠去势的结果一致。

垂体是机体“首要”的内分泌腺，在垂体分泌的促性腺激素刺激下，性腺分泌性激素，而摘除家禽的卵巢导致血清性激素水平紊乱，又可以负反馈调节垂体的激素分泌，引起垂体功能改变[4]。研究发现，摘除大鼠睾丸可引起垂体肥大和机能亢进[8]。本实验发现，摘除母鸡卵巢可显著增加垂体重，与Kitay[7]对雌性大鼠去势的结果一致。垂体有垂体前叶、垂体中叶和垂体后叶3个区域，垂体前叶包括远侧部和少量结节部，约占垂体重量的80%，在垂体分泌功能中起到主要作用。雌激素被认为可以使垂体前叶细胞快速凋亡[9]，这也是本实验中母鸡去势后垂体重量增加的原因。

SIX 同源蛋白家族、WNT/β-catenin 和Notch 信号通路以及SOX 转录因子等在垂体形成和功能维持过程中可能起到调控作用[10]。近年，Li 等[3]发现，雌激素受体调控通路中一个早期的应答基因GREB1 参与斑马鱼的垂体发育，GREB1 被发现与多种细胞分化能力有关，其表达量受到雌激素正向调控[11-12]。因此，本实验结果表明，去势母鸡垂体GREB1 mRNA 水平表达量显著低于正常母鸡，且垂体GREB1 表达量与垂体重量呈负相关。

4 结 论

在去势母鸡雄性化过程中，垂体和肾上腺发挥了重要作用。母鸡去势后，血清雌二醇浓度和肾上腺重量降低，垂体重量增加，与垂体发育相关的基因GREB1 表达量下降，这一结果为研究雌激素受体介导的垂体发育提供参考。腺体重量的改变将会引起腺体功能改变，去势后垂体、肾上腺中基因表达的变化还需进一步研究。