硝基呋喃类代谢物液质新方法验证技术报告

郭 睿 曹院章 王艳红 许东保 唐艳荣 张宛婧

（北京市朝阳区动物疫病预防控制中心，北京 100018）

1 实验室基本概况

2 方法原理

样品经盐酸水解，2-硝基苯甲醛过夜衍生，调pH值7.4后，用乙酸乙酯提取，正己烷净化。采用液相色谱/串联质谱仪定性检测，采用稳定同位素内标法进行定量测定。

3 试剂和材料

（1）甲醇（液相色谱纯）。

（2）乙腈（液相色谱纯）。

（3）乙酸乙酯（液相色谱纯）。

（4）乙腈饱和正己烷：量取正己烷80ml于100ml分液漏斗中，加入适量乙腈后，剧烈振荡，待分配平衡后，弃去乙腈层即可。

（5）盐酸（优级纯）。

（6）氢氧化钠（分析纯）。

（7）甲酸（液相色谱纯）。

（8）2-硝基苯甲醛（2-NBA）。

（9）三水磷酸钾（分析纯）。

（10）乙酸铵（优级纯）。

（11）盐酸溶液（0.2mol/L）：量取17ml浓盐酸（3.5）用水定容至1000ml。

（12）氢氧化钠溶液（2.0mol/L）：称取80g氢氧化钠（3.6）用水溶解，定容至1000ml。

（13）2-硝基苯甲醛溶液（0.1mol/L）：称取1.5g的2-硝基苯甲醛（3.8），用甲醇溶解，定容至100ml。现用现配。

（14）磷酸钾溶液（0.3mol/L）：称取79.893g三水磷酸钾（3.9）用水溶解，定容至1000ml。

（15）0.1%甲酸水溶液（含0.0005 mol/L乙酸铵）：准确量取1 ml甲醇（3.1）和称取0.0386g乙酸铵（3.10）用水溶解，定容至1000ml。

（16）标准品：呋喃它酮代谢物AMOZ、呋喃西林代谢物SEM、呋喃妥因代谢物AHD、呋喃唑酮代谢物AOZ、同位素内标D5-AMOZ、13C15N-SEM、13C3-AHD、D4-AOZ，纯度均大于99.0%。

（17）标准储备液（100mg/L）：准确称取适量标准品（3.16）（精确至0.0001g），用乙腈（3.2）配制成1mg/ml标准储备液。-18℃避光保存，有效期3个月。

（18）混合中间标准溶液（1mg/L）：准确移取标准储备液（3.17）各1ml于100ml容量瓶中，用乙腈定容，4℃避光保存，有效期1个月。

（19）混合标准工作溶液（0.01mg/L）：准确移取标准储备液（3.18）0.1ml于10ml容量瓶中，用乙腈定容，4℃避光保存，有效期1周。

（20）内标储备液（100mg/L）：准确称取适量标准品（3.16）（精确至0.0001g），用乙腈（3.2）配制成1mg/ml标准储备液。-18℃避光保存，有效期3个月。

（21）中间内标标准溶液（1mg/L）：准确移取内标储备液（3.20）各1ml于100ml容量瓶中，用乙腈定容，4℃避光保存，有效期1个月。

（22）混合内标标准溶液（0.01mg/L）：准确移取标准储备液（3.21）0.1ml于10ml容量瓶中，用乙腈定容，4℃避光保存，有效期1周。

（23）0.2μm微孔滤膜，有机相。

（24）氮气：纯度≥99.999%。

4 仪器和设备

（1）高效液相色谱-串联质谱联用仪：配有电喷雾（ESI）离子源。

表2 仪器使用情况登记表

（2）分析天平：感量0.01g、0.00001g。

（3）高速冷冻离心机：最大转速13000r/min。

（4）电热恒温振荡箱。

（5）pH计。

（6）旋涡混合器。

（7）平行蒸发仪。

（8）聚乙烯离心管：50ml。

（9）氮气吹干仪。

5 样品

5.1 样品制备

畜禽肉样、鲜活鱼样采集后选取无骨可食肌肉部分尽快匀质处理，处理完成后，要置于-18℃冰箱内避光保存。

5.2 样品水解和衍生化

准确称取2.00g样品，加入10ml甲醇-水混合溶液（1+1），均质1min，4000r/min离心5min，吸取上清液弃掉。残留物中加入10ml盐酸溶液（0.2mol/L），均质器10000r/min均质1min后，再加入100μl混合内标标准溶液（3.22），2-硝基苯甲醛溶液（0.1mol/L）100μl，涡旋混匀30s后，振荡30 min，置37℃恒温水浴振荡过夜（16h）反应。

5.3 提取和净化

上述衍生溶液放置至室温，加入1ml的 0.3mol/L磷酸钾溶液（3.14），用2.0mol/L氢氧化钠溶液（3.12）调pH至约7.4，再加入10ml乙酸乙酯，振荡10min后，10000r/min高速离心10min，收集乙酸乙酯层，残留物用乙酸乙酯重复提取一次，合并乙酸乙酯，在40℃下用氮气吹干，残留物用0.1%甲酸水溶液（3.15）溶解，再用3ml乙腈饱和的正己烷（3.4）分两次液液分配，去除脂肪，下层水相经0.2μm针孔过滤器过滤后，供液相色谱-串联质谱测定。

6 液相色谱-串联质谱条件

色谱柱：BEH C18柱，50 mm×2.1mm（i.d.），粒度1.7μm。

流动相：A相：0.1%甲酸水溶液（3.15）；B相：0.1%甲酸乙腈溶液。

梯度洗脱：0～7min，维持10% B；7～12min，4% A线性变化至60% A；12～12.1min，60% A线性变化至4% A；12.1～16min，维持4% A。

流速：0.4ml/min。

进样量：10μl。

柱温：35℃。

离子源：电喷雾ESI正离子。

扫描方式：多反应监测MRM。

监测离子对：

呋喃它酮代谢物AMOZm/z 335.1>100.1（定量离子），335.1>262.1；

呋喃西林代谢物SEM m/z 209.1>166.0（定量离子），209.1>192.0；

呋喃唑酮代谢物AOZ m/z 236.1>134.0（定量离子），236.1>104.0；

呋喃妥因代谢物AHD m/z 249.1>134.1（定量离子），249.1>104.1；

D5-AMOZm/z 340.1>296.1；13C15N-SEM m/z 212.1>168.0；

13C3-AHD m/z 252.0>134.0； D4-AOZ m/z 240.1>134.1。

7 验证项目及结果

7.1 方法检出限

方法中的定性离子的响应值低于定量离子的响应值，所以信噪比以定性离子的信噪比表示。四种硝基呋喃类代谢物中呋喃西林代谢物SEM的响应值最低，所以方法检出限以满足SEM的3倍信噪比判定。

测定12个独立样液，浓度为10μg/kg，进样量为10μl，得到四种物质定性离子信噪比，按照国标要求（一般以3倍信噪比的浓度作为最低检测浓度），通过信噪比指导进行稀释，最终稀释到1/50样液浓度为0.2μg/kg时，进样量为10μl，满足SEM的3倍信噪比，得到四种物质定性离子信噪比，本文仅以SEM为例，如表3：

7.2 校准曲线方程及线性范围

配置0.1μg/kg - 40μg/kg系列浓度混合标准溶液，上机检测，至少具备了6个标准点（包括0点），每个标准点独立制备了3个进行随机检测，因为方法中只需要对定量离子进行线性测定，所以只验证了四种物质定量离子的线性范围，线性回归方程的相关系数r＞0.995，本文仅以相关系数最低的SEM为例，见表4：

表3

表4

表5

7.3 方法的精密度测试

采用高（20μg/kg）、中（2μg/kg）、低（0.5μg/kg）3个浓度的实际样品，每个平行进样6次以上，以峰面积分别计算平均值、标准偏差、相对标准偏差，本文仅以响应值最低的SEM为例，检测结果如表5～表7：

综上所述，根据《GB/T 32465-2015 化学分析方法验证确认和内部质量控制要求》中7.4.4中的表4判定，参照标准《GB/T 21311-2007 动物源性食品中硝基呋喃类代谢物残留量检测方法 高效液相色谱/串联质谱法》开展的检测项目所有涉及的检测物质的精密度均符合规定，标准验证成立。

表4 （续） GB/T 32465-2015

7.4 方法准确度测试

取猪肉（P）、鱼肉（F）、羊肉（O）、鸡肉（C）、牛肉（B）各11份2g空白样品，先按照5.1对样品进行洗涤，然后按三个水平，每个水平三个重复添加四种硝基呋喃类代谢物混合标准溶液，静置30min后按照5.3所述方法进行水解衍生-提取-浓缩-净化，上机检测，本文中仅以猪肉（P）中四种硝基呋喃类代谢物准确度实验结果为例，检测结果如表8：

综上所述，根据《NY/T 1896-2010 兽药残留实验室质量控制规范》中附录D中的表D.2判定，参照标准《GB/T 21311-2007 动物源性食品中硝基呋喃类代谢物残留量检测方法 高效液相色谱/串联质谱法》开展的检测项目所有涉及样品种类中的检测物质的准确度均符合规定，说明该方法准确度良好，标准验证成立。

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8 结论

表6

表7

表9 本方法测定结果与要求对比表

表8 猪肉（P）中四种硝基呋喃类代谢物准确度实验结果

方法检测低限（LOQ）、线性范围、精密度和准确度均满足国标要求，本实验室可以正确运用和实施方法《GB/T 21311-2007动物源性食品中硝基呋喃类药物代谢物残留量检测方法 高效液相色谱/串联质谱法》。