猪丹毒杆菌的分离鉴定及药物敏感性试验

陈关雄 向必勇 幸更东 台晓媛*

（1.石林彝族自治县畜牧兽医总站，云南石林 652200；2.云南省种羊繁育推广中心，云南寻甸 655200；3.玉溪市红塔区畜禽改良站，云南玉溪 653100）

猪丹毒（Swine erysipelas）是由红斑丹毒丝菌（Erysipelothrix rhusiopathiae）引起的猪的一种急性热性传染病[1]。1876年Koch首次从患有败血病小鼠的血液中分离出本菌，1882年Louis Pasteur首次从病猪体内分离到本菌[2]。目前该病在世界上大多数国家都有分布，呈散发或流行性发生，不同年龄、性别和品种的猪均有易感性，但以3个月以上的生长猪发病率最高，牛、羊、马、犬、家禽及一些鸟类均可发病，也能危害人类健康[3-4]。临床病例可分为急性型、亚急性型和慢性型，急性型表现为体温急剧升高至42℃以上，病猪突然死亡，在颈部、耳后以及胸腹侧等处的皮肤上出现形状不同的红斑，手指按压会褪色；亚急性型表现为，在颈部、背部、胸侧以及四肢外侧等皮肤上出现不同大小的深红色疹块，扁平凸起，彼此间存在清晰界限；慢性型表现为皮肤坏死，浆液性纤维素性关节炎和疣状心内膜炎[5]。

猪丹毒的实验室诊断主要分为细菌的分离鉴定、血清学诊断和聚合酶链式反应（PCR）[6－7]。本研究通过对临床疑似猪丹毒发病死亡的生猪进行解剖，采集肾脏、脾脏和淋巴结进行细菌的分离培养，通过形态观察、生化鉴定、动物试验及药物敏感性试验来进行诊断和分析，为猪丹毒的预防和治疗提供指导。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料 石林县某养殖户临床疑似猪丹毒发病死亡的生猪，经解剖，无菌采取肾脏、脾脏、淋巴结等组织待用。

1.1.2 培养基 鲜血琼脂培养基、5%马血清琼脂培养基、5%马血清肉汤培养基。

1.1.3 主要试剂 葡萄糖、果糖、乳糖、鼠李糖、山梨醇、棉子糖、甘露醇、菊糖、蕈糖、蔗糖、水杨苷、尿素、H2S、MR、VP、靛基质、明胶。

1.1.4 试验设备 高压灭菌锅、超净工作台、生物显微镜、电子天平、恒温培养箱、试管、培养皿等，抗菌药物药敏纸片（杭州微生物试剂有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 细菌的分离培养 将采集到的肾脏、脾脏等样品无菌操作划线接种于鲜血培养基，37℃恒温培养24h－48h，观察菌落形态特征，挑取可疑菌落再次划线接种于鲜血琼脂培养基或5%马血清琼脂培养基进行纯培养，然后进行革兰氏染色，镜检，观察细菌的形态特征。

1.2.2 分离菌株的鉴定

（1）镜检：挑取分离菌落均匀涂布于载玻上，经酒精火焰固定后进行革兰氏染色、镜检。

（2）糖发酵试验：挑取分离菌株分别接种于含5%马血清的糖发酵培养基中，37℃恒温培养24～48h，根据指示剂的颜色变化，观察分离菌株对糖的分解利用情况。

（3）生化试验：挑取分离菌株分别进行尿素试验、H2S试验、MR试验、VP试验、靛基质试验、明胶穿刺试验，37℃恒温培养24～48h（明胶穿刺试验20℃）后，观察并记录结果。

1.2.3 动物试验 将分离菌株接种于5%马血清肉汤培养基，37℃恒温培养24h后，取肉汤培养物1ml经胸肌分别接种3只家鸽，另取1ml肉汤培养物经皮下接种2只豚鼠作对照，连续观察一周，记录发病及死亡情况。对攻毒死亡家鸽进行解剖，采取心血和肝脏等进行涂片染色和分离培养，并与分离菌株进行对照分析。

1.2.4 药物敏感性试验 挑取猪丹毒分离纯培养菌株接种于5%马血清肉汤培养基，37℃恒温培养24h后，取100μl培养物均匀涂布于5%马血清琼脂培养基，正向置于恒温培养箱，37℃干燥1h，用无菌摄子夹取药敏纸片贴于琼脂表面，37℃倒置恒温培养24h后，用游标卡尺测量抑菌圈直径，记录试验结果。结果判定参照美国临床试验室标准委员会（CLSI）2012版（标准）执行标准进行，同时以杭州微生物试剂有限公司提供的纸片法药敏试验抑菌圈直径判定标准作为参考。

2 结果

2.1 培养特性与细菌形态

37℃培养24h后，在鲜血琼脂上形成针尖大小，露珠样菌落，菌落呈圆形、灰白色，表面光滑、湿润，中部凸起，边缘整齐，菌落直径1-2mm。革兰氏染色阳性，菌体平直或稍弯曲的纤细小杆菌，两端钝圆，无鞭毛、无荚膜、不产生孢，呈V形、短链或堆状排列（图1、2）。

图1 鲜血琼脂培养物（100×16 革兰氏染色）

图2 马血清肉汤培养物（100×16 革兰氏染色）

2.2 生化试验

在加有5%马血清的糖培养基中可发酵葡萄糖、果糖、乳糖，产酸不产生；不发酵蔗糖、甘露醇、鼠李糖、棉子糖、山梨醇、菊糖、蕈糖、水杨苷。能产生H2S，不产生靛基质，MR及VP试验无阴性，不分解尿素（详见表1）。

表1 分离菌株生化试验结果

2.3 明胶穿刺试验

明胶穿刺试后，分离菌株沿穿刺线横向四周生长，呈试管刷状，不液化明胶（图3）。

图3 明胶穿刺试验

2.4 动物试验

将分离菌株培养物分种接种3只家鸽和2只豚鼠，在接种后18h，家鸽表现精神沉郁、羽毛蓬松、活跃程度下降、不食等症状；接种72h后，3只家鸽全部死亡，2只豚鼠均健康；观察至第7天，2只豚鼠仍然健康存活。对死亡的3只家鸽进行解剖，无菌采取家鸽的心血、肝脏分别进行涂片染色和分离培养。经涂片染色，可见大量纤细的革兰氏阳性小杆菌，呈V形、短链或堆状排列；将采集的肝脏、脾脏样品划线接种于鲜血琼脂培养基，37℃恒温培养24h，形成针尖大小，露珠样菌落，挑取菌落染色镜检和生化鉴定均和分离菌株的结果一致（图4、5）。

图4 鸽子肝脏触片（100×16 革兰氏染色）

图5 鸽子心血触片（100×16 革兰氏染色）

2.5 药敏试验

选用青霉素、氨苄西林、头孢吡肟等14种抗生素对分离菌株进行药敏试验，结果分离菌株对青霉素、氨苄西林、头孢吡肟、头孢曲松四种药物敏感，对红霉素、氟苯尼考两种药物中度敏感，对头孢氨苄、多西环素、恩诺沙星、甲氧苄氨嘧啶、阿奇霉素、复方新诺明、丁胺卡那霉素、左氧氟沙星耐药（详见表2）

3 讨论

本研究通过对病死生猪的组织样品进行分离培养、镜检形态、生化鉴定、动物回归试验，确定分离菌株为猪丹毒杆菌。

表2 药物试验结果

猪丹毒、猪瘟、猪肺疫在20世纪80年代和90年代初并称我国养猪业三大传染病[8]，然而，随着猪丹毒、猪瘟、猪肺疫疫苗和青霉素等抗菌药物的使用，猪丹毒临床病例已慢慢减少，在临床上已很难见到发病的情况。近年来，国家对生猪疫病防控重点随着生猪疫病的流行情况发生了改变，生猪养殖场（户）生猪疫病的防控重点也主要以病毒性疫病为主，往往忽略了细菌性疫病的防治，然而，丹毒丝菌可感染包括哺乳动物、禽和鱼类等70多种动物，对盐腌、火熏、干燥、腐败和日光等自然环境抵抗力强；加之，由于抗生素残留问题，许多饲料生产企业已不在饲料中添加抗生素或减少抗生素的添加量；再之，猪丹毒与猪瘟、猪流行性腹泻、猪蓝耳、猪圆环等疫病伴发，能加重本病的发生与流行等原因，造成猪丹毒有卷土重来之势，生猪养殖场（户）应重视猪丹毒的防治工作。

本研究通过选择临床常用、革兰氏阳性菌敏感、广谱的14种抗菌药物，对分离菌株进行了药物敏感性试验，结果显示，分离的猪丹毒杆菌对青霉素、氨苄西林、头孢吡肟和头孢曲松四种药物敏感，对红霉素、氟苯尼考中度敏感，其余药物均出现了耐药的情况。在临床诊疗过程中，治疗猪丹毒首选的药物还是青霉素类抗生素，当发现使用的抗生素治疗效果不好时，应及时分离菌株进行药物敏感性试验，筛选敏感抗菌药物来进行治疗，避免滥用药物，以提高治疗的效果，降低经济损失。