FOXP3和LAP蛋白在结直肠癌中的表达与临床意义

王文静　朱晓东　王经荣　蔡清强　蔡文聘　房太勇

【摘要】 目的：探讨FOXP3及LAP蛋白在结直肠癌中的表达与临床意义，为临床治疗结直肠癌提供实验理论基础。方法：收集2016年9月-2017年6月在福建医科大学附属第二医院诊治的健康体检者结直肠组织、患者结直肠腺瘤及结直肠癌组织，并对各组织进行H&E染色及病理诊断。运用Western-blot检测各组织中FOXP3及LAP蛋白的表达。分析各组FOXP3、LAP蛋白的表达水平，以及两种蛋白的表达与临床病理参数的关系。结果：（1）FOXP3及LAP蛋白在结直肠癌组的表达均高于结直肠腺瘤组及健康人组，差异有统计学意义（P<0.05）。（2）FOXP3及LAP蛋白的表达水平与腺瘤上皮内瘤变级别呈正相关，差异有统计学意义（P<0.05）。（3）FOXP3及LAP蛋白表达水平与淋巴结转移、癌细胞分化程度、肿瘤组织浸润深度、TNM分期呈正相关，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：FOXP3、LAP蛋白可能参与了腺瘤向癌的进展过程及肿瘤的发生发展过程。

【关键词】 结直肠癌; 结直肠腺瘤; LAP; FOXP3

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2019.17.080 文献标识码 B 文章编号 1674-6805（2019）17-0-04

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是临床上较常见的恶性肿瘤之一，根据国家癌症中心发布的《2017年最新中国肿瘤现状和趋势》显示：CRC的发病率及死亡率均高居第五位。表明CRC对我国人民的健康产生了重大威胁。对结直肠癌发病机制研究的深入能够帮助大家更早、更多地筛查出结直肠癌，进而达到早诊早治、提高生存率的目标。目前关于FOXP3及LAP蛋白在CRC及CRA组织中的表达情况的研究较少，两种蛋白在CRC组织中的表达情况如何并未明确。因而本研究旨在检测CRC及结直肠腺瘤（colorectal adenomas，CRA）组织中FOXP3及LAP蛋白的表达情况，并分别观察两种蛋白与临床病理参数的关系，观察这两种蛋白对结直肠癌的发病进程的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本研究经医院伦理委员会审批后同意执行。选取2016年9月-2017年6月在福建医科大学附属第二医院诊治的研究对象的组织标本，每例样本均详细记录对应患者一般资料（包括姓名、性别、年龄、联系方式、家庭住址）、临床信息（包括现病史、既往史、个人史、临床诊断、诊断时间、手术时间、相关实验室检查结果及影像学检查结果等）、病理资料（包括病理号、详细病理学描述、病理诊断等）、肿块大小、浸润深度、有无淋巴结转移等。其中健康人组：共收集25例，其中男12例，女13例，平均年龄（44±10）岁。结直肠腺瘤组：共收集25例，其中男16例，女9例，平均年龄（56±10）岁。腺瘤部位：直肠腺瘤5例，结肠腺瘤20例;肿瘤大小：>1 cm 16例，≤1 cm 9例;上皮内瘤变：高级别11例，低级别14例。结直肠癌组：共收集33例，其中男19例，女14例，平均年龄（61±12）岁。直肠癌14例，结肠癌19例;肿瘤大小：>5 cm 11例，≤5 cm 22例;有淋巴结转移19例，无淋巴结转移14例;浸润深度：T1～T4分别为5、5、10、13例;分化程度：高分化5例，中分化20例，低分化8例;TNM分期：Ⅰ～Ⅳ期分别为：2、16、14、1例。

1.2 组织标本

组织离体后分成两部分，一部分组织迅速置入-196 ℃液氮速冻，后转送入-80 ℃冰箱保存备用;另一部分组织放入10%福尔马林固定，行常规H&E染色，由专业病理科医师进行病理诊断，对于癌组织参照AJCC/UICC的结直肠癌TNM分期系统、中国结直肠肿瘤筛查、早诊早治和综合预防共识意见，并结合术中所见对结直肠癌组织进行诊断、分级和分期。

1.3 实验方法

1.3.1 H&E染色 取组织标本、冲洗、去除表面残留粪便及血液，放入10%福尔马林中固定大于12 h;脱水→透明→包埋→切片→贴片→脱蜡→染色→脱水Ⅰ和复染→脱水Ⅱ和透明→封藏。

1.3.2 Western-blot 提取组织蛋白，并采用BCA试剂盒检测提取的蛋白浓度;测定后将剩余蛋白提取液进行SDS-PAGE电泳（90 V 30 min，下層分离胶120 V 60 min）;采用PVDF膜进行转膜（100 V 60～90 min）;使用5%脱脂奶粉封闭后依次与一抗（鼠抗人FOXP3单克隆抗体1∶500稀释;鼠抗人LAP单克隆抗体1∶2 000稀释）、二抗（羊抗鼠单克隆IgG抗体1∶5 000稀释）反应，在避光条件进行曝光、采图，以GAPDH作为内参进行标准对照，分析FOXP3和LAP蛋白表达水平。

1.4 统计学处理

所有数据采用SPSS 21.0统计软件进行处理，计量资料数据以（x±s）表示，三组间的比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），两组间的比较采用t检验，等级指标采用Spearman相关系数分析，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 健康体检者结直肠组织、结直肠腺瘤及结直肠癌组织H&E染色结果

各组织常规H&E染色病理图，见图1、图2，A正常黏膜组织：腺体排列规则，腺体未见拥挤融合，核未见异型。B结肠腺瘤：腺体呈管状，排列规则，未见背靠背现象，腺体未见融合，未见成角，未见间质浸润。细胞轻度异型，位于基底层，未见病理性核分裂。C结肠腺癌：腺体不规则，呈背靠背融合，可见成角及坏死，间质纤维化，浸润明显。细胞重度异型，可见病理性核分裂。

2.2 健康体检者结直肠组织、结直肠腺瘤及结直肠癌组织中FOXP3及LAP蛋白表达情况

运用Western Blot检测各组织中FOXP3及LAP蛋白的表达情况，见图3，采用单因素方差分析对三组间的FOXP3及LAP蛋白表达量进行分析，见表1。

2.3 结直肠腺瘤组织中FOXP3及LAP蛋白的表达与临床病理参数的关系分析

（1）采用独立t检验对FOXP3及LAP蛋白的表达与临床病理参数之间的关系进行分析，见表2。FOXP3及LAP蛋白的表达水平与腺瘤年龄、性别、腺瘤部位、大小相关性尚不确切，差异无统计学意义（P>0.05）。（2）采用Spearman相关系数对FOXP3及LAP蛋白的表达与临床病理参数（等级指标）之间的关系进行分析，见表3，FOXP3蛋白的表达水平与腺瘤上皮内瘤变级别呈正相关（rs=0.838），高级别上皮内瘤变组高于低级别上皮内瘤变组（0.854±0.331，0.495±0.203），差异有统计学意义（P<0.001）。LAP蛋白的表达水平与腺瘤上皮内瘤变级别呈正相关（rs=0.849），高级别上皮内瘤变表达水平高于低级别上皮内瘤变（1.136±0.161，0.949±0.687），差异有统计学意义（P<0.001）。

2.4 结直肠癌组织中FOXP3及LAP蛋白的表达与临床病理参数的关系分析

（1）采用独立t检验分析FOXP3及LAP蛋白的表达与临床病理参数的关系，见表4。（2）采用Spearman相关系数分析FOXP3及LAP蛋白的表达水平与等级指标的关系，见表5。FOXP3蛋白与癌细胞分化程度呈正相关（rs=0.464），分化程度越低，表达水平越高（依次为0.497±0.332、0.990±0.629、1.441±0.679），差异有统计学意义（P=0.007）;与肿瘤组织浸润深度呈正相关（rs=0.588），浸润深度越深，表达水平越高（依次为0.574±0.582、0.687±0.268、0.815±0.347、1.488±0.732），差异有统计学意义（P<0.001）;与TNM分期呈正相关（rs=0.464），分期越晚，表达水平越高（依次为0.314±0.041、0.768±0.581、1.420±0.599、1.504），差异有统计学意义（P<0.001）。LAP蛋白的表达水平与癌细胞分化程度呈正相关（rs=0.680），分化越低表达水平越高（依次为0.736±0.201、0.995±0.460、1.825±0.453），差异有统计学意义（P<0.001）;与肿瘤组织浸润深度呈正相关（rs=0.543），浸润深度越深表达水平越高（依次为0.712±0.314、0.758±0.156、1.218±0.475、1.434±0.662），差异有统计学意义（P=0.001）;与TNM分期呈正相关（rs=0.567），分期越晚表达水平越高（依次为0.637±0.197、0.937±0.403、1.480±0.641、1.198），差异有统计学意义（P=0.001）。

3 讨论

目前认为结直肠癌是由饮食结构、生活环境、生活方式及遗传等多方面因素相互协同作用的结果。而在发病机制研究方面，已有一些研究从不同角度探索，如突变细胞周期和失巢凋亡途径、血管生成、信号转导等均在CRC的发生和进展过程中起了重要作用[1-4]。本研究检测健康人、结直肠腺瘤、结直肠癌组织中FOXP3及LAP蛋白的表达，探讨两者可能参与了腺瘤向癌的进展过程及肿瘤的发生发展过程。

3.1 FOXP3及LAP蛋白与结直肠腺瘤

结直肠腺瘤是最常见的CRC癌前病变。70%～80%的结直肠癌是由结直肠腺瘤演变而来，这个过程需要10～15年的时间[5]。目前认为腺瘤癌变的高危因素可能与患者年龄、饮食习惯、腺瘤的病理类型、大小、有无蒂、不典型增生程度等因素有关。但从其分子机制水平来看，似乎尚未发现能够准确预估腺瘤癌变风险的生物学指标。Hua等[6]通过检测结直肠腺瘤肿瘤微环境中的FOXP3+Tregs表达情况，他们发现腺瘤肿瘤微环境中FOXP3+Tregs表达增高。本研究中观察到腺瘤组织中的FOXP3蛋白高于健康人，这与Hua等所提出的FOXP3+Tregs在腺瘤肿瘤微环境中的表达相类似。笔者推测FOXP3蛋白对于腺瘤的发生可能有促进作用。另一方面，笔者观察到LAP蛋白在腺瘤组织中的表达与FOXP3蛋白相似，这提示LAP蛋白可能与FOXP3蛋白一样对于腺瘤的发生有促进作用。

2000年《WHO肿瘤病理学及遗传学分类：消化系统肿瘤》将结直肠腺瘤定义为有上皮内瘤变（intraepithelial neoplasia，IN）存在的病變，并将IN分为低级别上皮内瘤变（LGIN）和高级别上皮内瘤变（HGIN），其中有研究表明，80%的HGIN可在1年内进展为浸润癌。笔者研究发现FOXP3蛋白及LAP蛋白表达水平与上皮内瘤变级别呈正相关，且差异有统计学意义，这提示FOXP3与LAP蛋白可能参与了结直肠腺瘤的癌变过程，但两种蛋白之间的关系如何，是否为协同作用，仍需待后续研究证实。

3.2 FOXP3及LAP蛋白与结直肠癌

3.2.1 FOXP3蛋白与结直肠癌 2001年，Hinz等[7]首次在胰腺导管腺癌细胞和肿瘤中检测FOXP3蛋白的表达，发现FOXP3阳性的胰腺癌细胞能够遏制活化T细胞的增殖、抑制TGF-β与IL-10的表达和分泌，进而介导了免疫抑制和肿瘤免疫逃逸。这些都揭示了FOXP3蛋白在肿瘤免疫微环境中可能发挥着抑制免疫活性的作用，从而参与免疫抑制及肿瘤的免疫逃逸。Karanikas等[8]运用免疫组化与流式细胞术检测FOXP3蛋白在25种不同组织来源的肿瘤细胞系的表达情况，证实了这25种肿瘤细胞系均有表达FOXP3蛋白。而在结直肠癌方面，Grimmig等[9-10]研究小组均发现，结肠癌细胞中FOXP3蛋白表达与患者的不良预后相关，即肿瘤恶性度越高，则FOXP3蛋白表达水平随之升高，患者预后越差。本实验中所观察到的结果与之一致：笔者发现结直肠癌中FOXP3蛋白表达高于健康人黏膜组织，推测FOXP3蛋白表达的上调可能在正常结直肠上皮发展为CRC的过程中起着一定的作用。

恶性肿瘤的预后与有无淋巴结转移、癌细胞分化程度、肿瘤组织浸润深度及TNM分期等因素密切相关。在本研究中FOXP3蛋白与上述临床病理参数间的关系：有淋巴结转移者FOXP3蛋白表达较无淋巴结转移者高，且差异有统计学意义（P<0.05）。在FOXP3蛋白与癌细胞分化程度、肿瘤组织浸润深度及TNM分期的关系分析中，笔者发现癌细胞分化程度越差、肿瘤组织浸润深度越深、TNM分期越晚，FOXP3蛋白表达水平越高，这些均提示FOXP3蛋白可能参与肿瘤的发展、侵袭及转移。

3.2.2 LAP蛋白与结直肠癌 LAP在CRC中的研究主要围绕LAP+CD4+T细胞：Zhong等[11]发现CRC肿瘤微环境中LAP+CD4+T细胞的表达量增多，可能是抑制机体产生有效的抗肿瘤免疫应答，最终导致肿瘤的免疫逃逸，使肿瘤进行性生长的因素之一。而LAP蛋白在肿瘤组织中是否表达及其作用机制研究较少，是否与同样作为Tregs表面标志物的FOXP3作用相同，目前仍未明确。在本实验中笔者通过Western blot检测到LAP蛋白在CRC组织中有表达，并观察到LAP蛋白在CRC组织中的表达高于健康人结肠组织，这与Kim等[12]所研究的FOXP3蛋白在肿瘤组织中富集相似，提示LAP蛋白可能与FOXP3蛋白一样发挥着促进肿瘤发生的作用。在进一步分析其表达与有无淋巴结转移、癌细胞分化程度、肿瘤组织浸润深度及TNM分期等因素之间的关系时，发现LAP蛋白的表达与FOXP3蛋白在肿瘤组织中的表达相类似：在有淋巴结转移者组织中表达高，且癌细胞分化程度越差、肿瘤组织浸润深度越深、TNM分期越晚，LAP蛋白表达水平越高，说明LAP蛋白可能参与肿瘤的发展、侵袭及转移。

综上所述，结果提示LAP蛋白与FOXP3蛋白在结直肠癌的发生发展中可能有共同作用，但这两种蛋白表达的意义、调控机制及其与结直肠癌发生、发展及患者预后的关系还有待进一步探索。

参考文献

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（收稿日期：2019-01-09） （本文編辑：何玉勤）