结直肠癌组织中Claudin-3的表达及临床病理意义

陈宗池 蔡清强 房太勇

【摘要】 目的：探讨Claudin-3与结直肠癌的发生、浸润、转移之间的相关性。方法：收集笔者所在医院2016年9月-2017年6月结直肠癌组织（32例）、结直肠腺瘤组织（25例）及正常结直肠组织（25例），采用Western blot檢测各组织中Claudin-3的表达情况。结果：Claudin-3在结肠癌组的表达水平（0.915 89±0.690 15）明显高于结直肠腺瘤组（0.477 48±0.337 80）、正常结直肠组（0.203 15±0.218 27），差异均有统计学意义（P<0.05）;伴有淋巴结转移组Claudin-3水平（1.296 04±0.490 18）显著高于无淋巴结转移组（0.485 04±0.650 92），差异有统计学意义（P<0.05）;高分化组Claudin-3水平（0.135 52±0.176 06）低于中分化组（0.881 25±0.676 63），差异有统计学意义（P<0.05）;中分化组Claudin-3水平（0.881 25±0.676 63）也低于低分化组（1.485 91±0.375 22），差异有统计学意义（P<0.05）;而Claudin-3水平与患者年龄、性别及肿瘤大小、部位无关。结论：Claudin-3与结直肠癌的发生及分化程度、转移密切相关，而与患者年龄、性别及肿瘤大小、部位无关;Claudin-3有可能成为结直肠癌早期诊断的检测指标，并可能为临床治疗结直肠癌提供潜在的治疗靶点。

【关键词】 结直肠癌; Claudin-3; 蛋白免疫印迹法

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2019.17.001 文献标识码 A 文章编号 1674-6805（2019）17-000-03

【Abstract】 Objective：To investigate the relationship between Claudin-3 and the occurrence，invasion and metastasis of colorectal cancer.Method：Colorectal cancer tissues（32 cases），colorectal adenoma tissues（25 cases） and normal colorectal tissues（25 cases） were collected from September 2016 to June 2017.All tissues were detected by Western blot.The expression of Claudin-3.Result：The expression level of in Claudin-3 in colon cancer group（0.915 89±0.690 15） was significantly higher than that colorectal adenoma group（0.477 48±0.337 80），normal colon group（0.203 15±0.218 27），the differences were significant（P<0.05），and lymph node metastasis group（1.296 04±0.490 18） was significantly higher than the no lymph node metastasis group（0.485 04±0.650 92），the difference was significant（P<0.05），the expression level in the highly differentiated group（0.135 52±0.176 06） was lower than that in the moderately differentiated group（0.881 25±0.676 63），the difference was significant（P<0.05）.The expression level of the moderately differentiated group（0.881 25±0.676 63）was also lower than that of the poorly differentiated group（1.485 91±0.375 22），the difference was significant（P<0.05），but not related to the patients age，gender，tumor size and location.Conclusion：Claudin-3 is closely related to the occurrence and differentiation of colorectal cancer，and it is not related to the age，sex，tumor size and location of patients.Claudin-3 may be a marker for early diagnosis of colorectal cancer，and may be clinical treatment of colorectal cancer provides a potential therapeutic target.

【Key words】 Colorectal cancer; Claudin-3; Western blot

First-authors address：The Second Affiliated Hospital of Fujian Medical University，Quanzhou 362000，China

目前，我国结直肠癌（colorectal carcinoma，CRC）发病位居恶性肿瘤第4位，近年来仍有上升趋势，且总体上的预后较差，严重威胁人类健康[1]。但其具体的发病机制尚不明确，而上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的研究越来越受到人们的重视。有研究证实，在癌症的发生及进展过程中EMT起到了重要作用，其主要表现是在肿瘤边缘细胞处破坏紧密连接结构。紧密连接（tight junction，TJ）是相邻细胞膜共同构成的一个屏障。TJ与细胞的增殖、分化的调控和肿瘤细胞的转移有关[2]。紧密连接蛋白（claudin）是TJ的主要结构蛋白之一。有关于Claudin-3在结直肠癌中表达的相关性研究已有报道，但是对于Claudin-3的表达与CRC发生、转移、预后之间的相关性目前报道少见，并且尚没有明确的定论。本研究通过检测Claudin-3在不同病理参数的CRC组织、腺瘤组织及正常结直肠组织中的表达水平变化。探讨Claudin-3与CRC的发生、浸润、转移之间的相关性，为结直肠癌的早期发现、诊断及了解其预后提供新途径，继而为临床结直肠癌治疗提供潜在的药物治疗新靶点。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2016年9月-2017年6月在笔者所在医院治疗的结直肠癌、结直肠腺瘤患者及门诊健康体检者82例，其中结直肠癌组32例，平均年龄（60±14）岁;结直肠腺瘤组25例，平均年龄（54±11）岁;正常结直肠组25例，平均年龄（45±14）岁。所有研究对象均知情同意并由医院伦理委员会审批同意，所有患者术前未进行新辅助放化疗、生物治疗等其他抗肿瘤治疗，无合并其他恶性肿瘤、炎症性肠病等，均有完整的临床病理资料，组织标本均保持完整，由两名专业的病理科医生进行病理诊断确诊，并行Claudin-3蛋白免疫印迹（Western blot，WB）检测。

1.2 仪器及材料

鼠抗人Claudin-3多克隆抗体、羊抗鼠单克隆IgG抗体、GAPDH抗体、BCA蛋白定量分析试剂盒、BB5060型CO2孵箱、ECL发光扫描仪、蛋白电泳仪、蛋白核酸定量仪（power PAC 2000型）等。

1.3 实验步骤及检测项目

1.3.1 病理检查及HE染色 取每例部分组织标本进行固定、脱水、包埋、切片，进行HE染色观察各组标本显微镜下的形态学改变，并区分结直肠癌组织的病理特征。

1.3.2 WB检测各组织中Claudin-3表达水平 取剩余组织标本-80 ℃冻存组织，进行组织裂解，按照BCA法测定蛋白质浓度，将剩余的蛋白提取液制定成蛋白样品，再通过电泳、转膜，进行抗体杂交，进行曝光底片，多次重复后扫描照片，采集图片信息并处理分析。

1.4 统计学处理

所有数据采用SPSS 22.0统计软件进行统计处理，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，对于符合正态分布且方差齐的两组间的均数比较采用t检验，对于方差不齐的采用近似t检验;相关性分析采用Spearman分析;P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结直肠癌组、结直肠腺瘤组、正常结直肠组的病理及HE染色

结果见图1。正常结直肠组（HE×400），腺体排列规则，未见拥挤融合，核未见异性性;结直肠腺瘤组（HE×400），腺体呈管状，排列规则，未见融合、背靠背现象、间质浸润，核轻度异性，位于基底层，无病理性核分裂;结直肠癌组（HE×400），腺体不规则，呈背靠背融合，可见成角及坏死，间质纤维化、浸润。细胞重度异型，核分裂多见，并可见病理性核分裂。

2.2 结直肠癌组、结直肠腺瘤组、正常结直肠组中Claudin-3的表达

结直肠癌组中的Claudin-3表达水平明显高于结直肠腺瘤组，差异有统计学意义（t=3.123，P<0.05）;结直肠癌组中Claudin-3表达水平也显著高于正常结直肠组，差异有统计学意义（t=5.459，P<0.05），見图2、表1。Spearman相关性分析显示Claudin-3的表达水平在正常结直肠组、结直肠腺瘤组、CRC组中呈中度正相关（r=0.490，P=0.000）。

2.3 Claudin-3在不同临床病理参数CRC患者中的表达

2.3.1 淋巴结转移 与结直肠癌组伴随淋巴结转移中的Claudin-3表达水平相比，无淋巴结转移的结直肠癌组中的Claudin-3表达水平明显低，差异有统计学意义（t=4.010，P<0.05），见表2。Spearman相关性分析显示Claudin-3的表达水平与有无淋巴结转移呈中度正相关（r=0.675，P=0.000）。

2.3.2 远处转移 本研究中，远处转移病例只有1例，表达水平为2.164 38，较无远处转移组（0.875 62±0.668 54）明显高，但远处转移例数太少，无法进行统计学分析。

2.3.3 TNM分期 Ⅲ期结直肠癌组中的Claudin-3表达水平显著高于Ⅰ期结直肠癌组和Ⅱ期结直肠癌组，差异有统计学意义（t=4.185、2.943，P=0.001、0.007），见表3。Ⅳ期仅1例，不参与统计学比较。Spearman相关性分析显示Claudin-3的表达差异在CRC不同TNM分期中具有高度的正相关性（r=0.709，P=0.000）。

2.3.4 组织学分级 Claudin-3在组织学分级中的高分化（1级）中的表达结果低于中分化（2级），差异有统计学意义（t=2.406，P=0.025）;中分化的表达水平也低于低分化，差异有统计学意义（t=2.362，P=0.026），见表4;Spearman相关性分析显示Claudin-3的表达水平在高分化组、中分化、低分化组中依次升高，呈中度正相关（r=0.650，P=0.000）。

2.3.5 其他临床病理参数 Claudin-3在CRC组织中的表达水平与患者年龄、性别及肿瘤大小、部位无关，差异无统计学意义（P>0.05），见表5。

3 讨论

TJ是细胞黏附的主要方式之一，调控着细胞旁通路的通透性，保持细胞极性。Claudin是构成TJ的主要蛋白之一，Claudin的表达水平的改变会使得细胞极性破坏、细胞黏附能力下降，与肿瘤的发生、进展及预后密切相关，但其确切的发生机制尚不清楚。

本文研究结果显示，结直肠癌组中的紧密连接蛋白-3的表达水平明显高于结直肠腺瘤组及正常结直肠组，另外，结直肠腺瘤组的紧密连接-3蛋白量也显著高于正常结直肠组。Spearman分析提示Claudin-3的表达水平呈中度正相关。Tokuhara等[3]通过体外细胞研究同样发现，紧密连接蛋白-3在CRC细胞中呈高表达，提示Claudin-3表达的上调可能参与恶性肿瘤的发生。目前对于其具体作用机制尚未完全明确。但有研究报道，当Claudin蛋白的表达异常时，使得上皮细胞对细胞旁通路通透性的调节异常及获取侵袭表型从而向具有可以活动特性的间质细胞转化，促进癌症的发生[4]。

目前对于Claudin-3在CRC组织中的表达水平上升的机制仍未完全清楚。Wang等[5]通过小鼠动物模型对CRC组织中的Claudin-3蛋白表达情况的改变进行体内、外研究，研究表明，Claudin-3在CRC组织中的水平可通过SCF/c-kit/JNK/AP-1信号转导通路的激活可以使之升高，Claudin-3的异常表达可能与CRC的发生有关。表明Claudin-3有可能成为CRC早期诊断的检测指标。

对于不同分化程度，Claudin-3的表达水平随着CRC分化程度的不同差异明显，分化程度越低，肿瘤恶性度越高，Claudin-3的水平越高。Claudin-3除了“屏障和栅栏”功能外，在细增增殖、分化中的作用也逐渐被发现[6-7]。Escudero-Esparza等[8]研究认为，紧密连接蛋白的表达异常使得肿瘤细胞早期出现黏附能力的丢失，细胞旁通路调节受损及细胞之间的信号转导通路受到阻碍，而在肿瘤生长晚期的时候，这种内环境的改变令细胞极性丢失和细胞在生长、分化上出现差异。

同时发现淋巴结转移组中的紧密连接蛋白-3的水平显著高于无淋巴结转移组，相关性分析显示呈正相关。研究发现，癌细胞转移的重要步骤是对间皮细胞和内皮细胞的侵袭[9]，而肿瘤转移涉及到一系列的级联反应，只有完成这些级联反应，癌细胞才能转移到远处。而要完成上述转移级联反应时，必须得破坏TJ的屏障作用，导致细胞极性和细胞的黏附能力丢失。Claudin在癌症细胞黏附功能的丢失、转移过程起着非常重要的作用。因此，破坏Claudin蛋白维持TJ的完整性是转移级联反应发生的关键步骤。其他学者研究发现Claudin-3在其他癌组织中同样具有类似的结果[10-11]。Tokuhara等[3]通过对体外细胞研究发现，从CRC患者的转移淋巴结中分离出来的SW620细胞中Claudin-3的表达水平显著升高，并且SW620细胞具有显著的转移特征，提示着Claudin-3的异常表达可能与肿瘤的侵袭、转移相关。而CRC患者的年龄、性别及肿瘤大小、部位与CRC组织Claudin-3的表达水平无关，差异无统计学意义。

而在治疗方面，靶向药物治疗是目前恶性肿瘤治疗的热点研究方向。产气荚膜梭菌肠毒素是Claudin-3第二胞外环的高亲和力天然配体，可以与Claudin-3结合形成膜孔复合物，使得细胞迅速死亡，并且Claudin-3在人类CRC、食管癌、上皮性卵巢癌等癌症组织中均呈高表达，这为Claudin成为靶向治疗恶性肿瘤提供了可能性。并且Pahle等[12]已经报道了产气荚膜梭菌肠毒素基因在体内外进行基因转移靶向治疗结肠癌成功的应用。综上所述，提示Claudin-3有可能成为CRC早期诊断的检测指标，并可能成为临床治疗CRC提供治疗靶点。

目前国内对Claudin-3在CRC组织的异常表达的研究较少，本研究不仅分析了Claudin-3在结直肠腺瘤与CRC之间的表达差异;同时分析了Claudin-3的异常表达与CRC不同病理参数之间的关系，探讨Claudin-3有可能成为CRC早期诊断的检测指标。但本研究样本量较小，缺少对Claudin-3相关机制及调节剂的研究及研究时间短;以期能多中心合作，扩大样本量，为Claudin-3能否成为CRC早期诊断的检测指标及临床治疗CRC提供治疗靶点提供更多依据。

参考文献

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（收稿日期：2019-01-14） （本文編辑：何玉勤）