复合贻贝调味酱工艺的探讨

廖登远，涂艺山，吴靖娜，刘淑集，陈晓婷

(1.福建省水产研究所，福建省海洋生物增养殖与高值化利用重点实验室，福建 厦门 361013；2.福建中医药大学，福建 福州 363001)

贻贝也称海红、壳菜、淡菜，是我国重要的养殖贝类之一。贻贝具有“海中鸡蛋”的美称，含有丰富的微量元素，如钙、铁、锌、磷、维生素等，还含有较其他海产品更丰富的多糖、蛋白质、牛磺酸、氨基酸、活性多肽等物质，对促进新陈代谢等人体活动具有积极作用[1]。贻贝分布于我国山东、福建、浙江等沿海省份的滩涂区域。贻贝药用在我国已有悠长的历史，据《本草纲目》记载：“淡菜具有治疗虚劳疲惫、精血衰少、吐血久痢、肠鸣腰痛等功效”；也有其他药理解释，贻贝性温，补五脏，治腰脚，调经活血，适宜中老年体质虚弱、气血不足、营养不良者，以及患有肾虚腰痛、动脉硬化、耳鸣眩晕等症状的人食用[2]。

在食品加工过程中，对贻贝的使用是通过蒸煮取其肉进行加工，其蒸煮液通常都被直接废弃。但蒸煮液不仅含有一定的碎贻贝肉及丰富的脂肪、蛋白质、维生素和微量元素，也有牛磺酸、活性多糖、游离氨基酸等生物活性物质，不对其多加以利用，既造成环境的污染，还造成资源浪费[3-4]。因此，本实验以贻贝蒸煮液及碎肉为原料，并以感官评分及电子鼻对气味物质的测定分析结果为指标，研究去腥、调味最佳条件，通过酶解处理得到富含游离氨基酸、具有一定抗氧化活性功能的小分子肽酶解液，获得研制新型贝类调味品的理想原料，这对有效回收利用贻贝蒸煮液、开发海鲜调味酱具有重要意义。随着对贻贝加工利用研究的日趋普遍与深入，开发具有一定活性功能的贻贝深加工产品具有广阔的发展前景。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要原料

新鲜贻贝(厦门市场)洗净后蒸煮至开口，获得蒸煮液及其碎肉。

1.1.2 酶

木瓜蛋白酶(100×104U/g)、动物蛋白酶(20×104U/g，海产品水解酶)：南宁庞博生物工程有限公司。

1.1.3 辅料

陈醋、原盐、白砂糖、味精、花椒、八角、茴香、桂皮、料酒、葱、姜、蒜、辣椒、食用调和油等均购于厦门某超市。

1.1.4 试剂

NaOH(0.054 75 mol/L)、邻苯二酸甲等均为分析纯。

1.2 主要仪器与设备

PEN3.5型电子鼻： AIRSENSE公司；916自动电位滴定仪：瑞士万通中国有限公司；vx-55型德国Systec高压灭菌锅：上海书俊仪器设备有限公司。

1.3 方法

各种成分测定依据相关国家标准文件要求进行：氨基酸态氮测定依据GB 5009.235—2016《食品中氨基酸态氮的测定》；牛磺酸的测定依据GB 5009.169—2016《食品中牛磺酸的测定》；蛋白质的测定依据GB/T 5009.5—2016《食品中蛋白质的测定》；脂肪的测定依据GB/T 5009.6—2016《食品中脂肪的测定》。电子鼻成分测定根据仪器规程进行。微生物检测依据GB 4789.26—2013《食品微生物学检验中商业无菌检验》；汞的测定依据GB 5009.17—2014《食品中总汞及有机汞的测定》；砷的测定依据GB 5009.11—2014《食品中总砷及有机砷的测定》；铬的测定依据GB 5009.123—2014《食品中铬的测定》；N-亚硝胺类化合物的测定依据GB 5009.26—2016《食品中N-亚硝胺类化合物的测定》。

1.4 工艺流程与操作要点

1.4.1 基本工艺流程

贻贝蒸煮液→除杂→调pH值→酶解→灭活→过滤→浓缩→调味→复配→装罐→灭菌→成品。

1.4.2 操作要点

原料选择与处理：应保证贻贝新鲜且去除死贝、泥贝，贝类开壳前用清水清洗数次，去除其表面的污垢，减少可能的污染源。蒸煮前用沸水浇洒以去除海水，将适量贻贝装框并置于沸水中煮制2～3 min至开壳，迅速捞出取肉，去足丝，保留乳白色蒸煮液及部分碎肉[5]。控制煮制时间，避免因煮制时间过长造成肉质的损坏、汁液流失而影响产品鲜味，同时也应避免因煮制时间不足而难以开壳取肉[6]。

复合酶解：调节蒸煮液pH=6.5，添加木瓜蛋白酶和动物蛋白酶复合酶。最佳水解参数：添加量木瓜蛋白酶0.5%、动物蛋白酶0.5%、反应温度55℃ 、pH7.0、水解时间5 h。

过滤、浓缩：放入Eppendorf Centrifuge 5804R离心机(8 000 r，15 min)，离心过滤。将滤液移入旋转蒸发器，调节旋转速度(20 r/min)、真空度(0.2 MPa)、加热温度(60℃)浓缩，3 h至20 Be(波美计)[7]。

调味：1)去腥处理，同时要求去腥料新鲜无病虫害、无腐烂、干瘪、无不良气味等，对酶解蒸煮液添加去腥料进行去腥处理；2)对贻贝肉进行处理，用料酒将泡制(3～5次)过的贻贝肉腌制20 min后放入锅中，并添加葱、姜、蒜进行烹炒，煮熟入味后盛出，备用；3)将烹制好的贻贝肉加入蒸煮液中，搅拌均匀，装罐[8]。

排气、灭菌 ：灌装完成进蒸屉排气，排气时迅速旋紧，置灭菌锅内高温高压灭菌(121℃，20 min)。在此过程中需避免排气后冷却时间过长，从而影响排气效果。

1.4.3 工艺配方

以贻贝蒸煮液为基料，贻贝肉∶蒸煮液=1∶1，并按一定比例加上辅料：去腥料液4.0%、香辛料液6%。

2 实验方案设计

2.1 不同条件下复合酶解的单因素实验

以贻贝蒸煮液为原料，依据预实验，采用动物蛋白酶和木瓜蛋白酶进行单因素酶解实验，探讨水解贻贝蒸煮液酶解的最适工艺参数。两种蛋白酶的单因素实验条件：1)酶解温度的单因素实验条件：固定加酶量0.5%、水解时间5 h、pH 6.5不变，以温度为变量；2)加酶量的单因素实验条件：固定温度55℃、水解时间5 h、pH 6.5不变 ，以加酶量为变量；3)pH值的单因素实验条件：固定温度55℃、水解时间5 h、加酶量0.5%不变，以pH为变量；4)水解时间的单因素实验条件：固定加酶量0.5%、温度55℃、pH 6.5不变，以水解时间为变量。

以单因素实验结果为基础设计正交实验，以水解度为指标，得到双酶水解的最佳参数，实验设计因素为A(加酶量)、B(pH)、C(时间)、D(温度)，设计方案如表1所示。

表1 双酶水解正交实验设计方案

2.2 去腥料的去腥效果影响

去腥料由大小茴香、八角、桂皮、料酒、胡椒等煮制而成去腥料液，考察去腥料的不同添加量(2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%)对贻贝酱去腥效果的影响。

表2 去腥料添加量对风味的影响

2.3 香辛料液对贻贝酱风味的影响

所用香辛调味料由生姜、葱、蒜头、辣椒烘干磨粉制成，在优选去腥料液添加量基础上，设置不同香辛料的添加量(2%、4%、6%、8%、10%)，考察其对贻贝酱风味的影响。

表3 香辛料液的添加量对风味的影响

2.4 灭菌时间对贻贝酱风味的影响

选定最佳去腥料、香幸料液的添加量及灭菌温度(121℃)，设置不同的灭菌时间(10、15、20、25 min)，分别对经不同灭菌时间后的贻贝酱进行感官评价。

2.5 贻贝肉块形式对风味和感官的影响

考察不同形式的贻贝肉(整个、小块、搅碎)对风味及感官的影响。

3 结果与分析

3.1 不同酶解条件对贻贝蒸煮液水解效果的影响分析

从图1看出：在加酶量、固液比、水解时间、pH一定，仅改变酶解温度时，木瓜蛋白酶、动物蛋白酶在55℃时分别达到各自最好的酶解效果，说明在该温度下，复合酶解可以同步进行，并达到较好的酶解效果。

在温度、固液比、水解时间、pH一定的情况下，只改变加酶量的水解情况，如图2所示，动物蛋白酶在加酶量0.5%～0.6%时水解度达到最高，木瓜蛋白酶在加酶量0.4%～0.5%时酶解效果最好，动物蛋白酶在加酶量0.5%之前酶解度上升较快，之后趋于平缓，说明在加酶量0.5%之后动物蛋白酶加酶量对酶解度影响较小；木瓜蛋白酶加酶量0.4%之前水解度增加较快。综合结果，本实验选取加酶量为0.5%。

从图3看出：在加酶量、固液比、水解时间、温度一定，只改变pH的水解情况下，动物蛋白酶、木瓜蛋白酶在pH=6.5时水解度最高，此后动物蛋白酶趋于平缓，而木瓜蛋白酶随着pH值的增加呈现降低趋势，故选取6.5为最适pH值。

从图4看出：在加酶量、固液比、pH、温度一定的情况下，水解进行至5 h后，动物蛋白酶和木瓜蛋白酶总体的酶解度的增加趋于平缓，此后随着时间的增加，水解度增加不明显，故选取5 h为最佳酶解时间。

为验证各因素协同作用的效果，以水解度为指标，实验设计因素为A(加酶量)0.4%、0.5%、0.6%；B(pH)6.0、6.5、7.0；C(时间)4、5、6 h；D(温度)50、55、60℃为变量进行正交实验，以期得到双酶水解的最佳条件。

表4 复合酶水解的设计方案及实验结果

由表4可见，用木瓜蛋白酶和动物蛋白酶复合酶解，根据各因素极差值可知，各因素对酶解效果的影响程度依次为C(时间)>A(加酶量比)>B(pH)>D(温度)，最佳实验组合为A2B3C3D1。由于蛋白酶对肽键的专一性，当采用一种蛋白酶对贻贝中的蛋白质进行水解时，一种酶只能作用于特定的氨基酸残基上，导致蛋白质水解程度受到很大的限制；但如果采用两种对肽键作用方式不同的蛋白酶对贻贝中的蛋白质进行水解，会增加蛋白酶在肽键上的作用位置，从而得到较高水解度的蛋白质水解液。综合图1～4和表4，确定最佳水解参数为木瓜蛋白酶添加量0.5%、动物蛋白酶添加量0.5%、温度55℃、pH 6.5、水解时间5 h。

3.2 不同去腥料添加量对贻贝酱风味的影响分析

组织一定数量的人员进行感官评分，结果如表5所示。综合考虑多种因素后，选取4.0%去腥料作为最佳添加量，此时产品在色泽、气味、滋味、组织形态都处于最佳。

表5 去腥料对贻贝酱风味影响的感官评分

对于不同添加量的去腥料物料气味物质进行电子鼻检测，并进行主成分分析(Principal component analysis，PCA )，结果如图5所示。不同去腥料物料的第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2)的方差贡献率分别为92.04%和2.66%，两者之和的累积方差贡献率达到94.70%。不同添加量的去腥料罐头含有的气味物质有差异，但对4%去腥料多次测定，其突出值相近，说明气味物质相近且较为稳定，而其余浓度的多次测定值间差异较大，故去腥料浓度选取4%较为合适。

对不同添加量的去腥料汤液气味物质进行电子鼻检测，并进行PCA分析，结果图6所示。不同去腥料汤液的第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2)的方差贡献率分别为94.73%和5.27%，两者之和的累积方差贡献率达到100%。去腥料贻贝块及酱汁风味物质的PC图累积率分别为94.7%、100%，因此结果是可信的，选取4%的去腥料浓度是可行的。另外两者PCA图综合表明，硫化物及芳香成分类的有机硫化物气味物质含量丰富，是贻贝酱的主要物质；甲基类、醇类、醛酮类气味物质等组成汁液风味物质，氢化物等气味物质主要处于贻贝肉块中。苯类、氨类、短链烷烃等芳香成分及长链烷烃在肉浆及汁液的风味物质都为定值，说明这几类气味物质与去腥料的添加无关。距离出现的点位相距越小，说明所含气味物质越相近。添加4%去腥料的产品，在色泽、气滋味、组织形态等都处于最佳，这与综合感官评分相符，因此实验选择4%去腥料浓度。

3.3 不同香辛料液添加量对贻贝酱风味的影响分析

表6 香辛料液对贻贝酱风味影响的感官评分

由表6可看出，随着香辛料液添加量的增加，色泽基本呈递增趋势，但组织形态呈递减趋势，出现这种情况可能原因是香辛料液颜色深且溶解于汁液中，影响了产品整体的颜色；而对于组织形态差异可能是原辅料在前处理中去除水分不完全或香辛料液的增加导致含水量增加，进而导致在高温灭菌后肉质发生软化。添加2%～6%香辛料液，气滋味评分增加；添加6%～8%香辛料液，气滋味评分下降，其中6%最高，说明香辛料液的量会影响气滋味，且有一定的阈值。综合考虑色泽、气滋味、组织形态对于产品的影响程度和结合感官评分[9]，选取香辛料液最佳添加量为6%。

对添加不同量的香辛料液贻贝酱的气味物质进行电子鼻检测，并进行PCA分析[10]，结果如图7所示。对添加不同量的香辛料液的贻贝酱的第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2)的方差贡献率分别为97.72%和2.28%，两者之和的累积方差贡献率达100%，不同添加量的香辛料液贻贝酱含有的气味物质差异各有不同。综合考虑产品的气味物质的相似性、气味物质含量及感官评分，因此本实验选择6%香辛料液作为最佳添加量。

3.4 灭菌温度、时间对贻贝酱风味的影响分析

表7 灭菌时间对贻贝酱风味影响的感官评分

由表7可看出，随着灭菌温度的增加，色泽、气滋味基本呈下降趋势，组织形态则呈递增趋势。色泽下降可能是高温使原辅料失去光泽。在不同的灭菌时间中，20 min色泽与组织形态最好，10 min气滋味最好。色泽从10～20 min呈递增趋势，25 min下降，说明其色泽具有一定阈值。气滋味和组织形态没有呈现明显规律。综合感官评价，选取121℃、15 min为最佳灭菌工艺条件。

3.5 不同形状对风味和感官的影响分析

电子鼻样品：样品一为贻贝酱(贻贝肉切块)；样品二为贻贝酱(贻贝肉搅碎)；样品三为贻贝酱(整个贻贝)；样品四为贻贝酱(贻贝肉切块)；电子鼻数据分析：取稳定后第294～296 s的数据信息进行PCA 分析。

由图8及参照电子鼻的响应类型芳香成分分析可知，氨类、芳香成分、苯类、长链烷烃、氢化物、短链烷烃芳香成分等气味物质含量极少，响应值都在0.9以下，普遍低于其他响应类型。响应值较为明显的是W1W对硫化物灵敏(葱蒜中的香辛成分的主体为硫化物)，W2W(芳香成分)对有机硫化物灵敏，W2S对醇类、醛酮类灵敏，W1S对甲基类灵敏(酒类、酱类、食醋气味主体成分分别是醛类、甲基硫、酯类)，说明肉酱中香味、酱味、香料味较为明显。而对四组做对比可以得出，变化从大到小排列为W1W>W2W>W2S>W1S，说明贻贝肉块完整性影响着酱料的气味，破碎肉中风味较轻，贻贝肉越完整，风味越浓厚[11]。贻贝酱中氮氧化合物、硫化物及芳香成分类的有机硫化物这几类气味物质含量丰富，硫化物类型气体最多。芳香成分(苯类、氨类、短链烷烃、长链烷烃)类型气味物质在图中为定值，对氢化物有选择性的气味物质等在贻贝酱中含量丰富，而在去腥过程中融入的甲基类、醇类、醛酮类等气味物质(香辛料液汁液)，增强了酱体的风味。

4 结论

研究双酶对贻贝蒸煮液的水解效果，确定最适宜的蛋白酶及其水解工艺参数为木瓜蛋白酶0.5%、动物蛋白酶0.5%、温度55℃、pH 6.5、水解时间5 h。最佳去腥料、香辛料液添加量分别为4.0%、6.0%，其余配比为增稠剂1.0%、白糖1.3%、陈醋0.5%、香油4.0%、食盐1.0%。利用贻贝蒸煮液加工开发海鲜调味酱，可有效回收利用贻贝蒸煮液，提高贻贝的综合价值。