霍山石斛与铁皮石斛的体外生物活性比较

马荣锋,唐 川,汪雯瀚,杨 焱,田小军,戴亚峰,王升贵,*

(1.九仙尊霍山石斛股份有限公司,上海 201199; 2.农业部南方食用菌资源利用重点实验室,国家食用菌工程技术研究中心,上海市农业科学院食用菌研究所,上海 201403)

霍山石斛(DendrobiumhuoshanenseCZ. Tang et S.J. Cheng)与铁皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)均属兰科石斛属多年生草本植物,具有滋阴清热、益胃生津、润肺止咳、保肝明目等功效,有很高的开发利用价值[1-2]。霍山石斛,又称“米斛”,其植株矮小,长3～9 cm,茎直立由下向上逐渐变细,呈圆锥状,形似米粒,花呈淡黄绿色,明显区别于铁皮石斛等其它石斛,具有独特的地理分布、形态特征、遗传结构及药理活性[2-3]。现代研究发现,霍山石斛及铁皮石斛中最主要的活性成分是多糖类化合物,在提高免疫力、降血糖、抗肿瘤、抗氧化、保肝护胃及抗白内障等方面具有明显的药理作用。前期研究发现,石斛中除多糖外,还含有生物碱、多酚、黄酮(柚皮素)、菲类物质(毛兰素)等小分子成分,不同石斛因含有独特的化学物质及结构,从而表现出不同的药理作用[4]。

石斛种类较多(80余种),且功效差别很大,传统医学认为霍山石斛是最道地、最为珍贵的石斛品种,但目前,对于药用石斛之间功能成分及生物活性等比较研究的报道也较少。王雅文等[5]对铁皮石斛和霍山石斛种甘露糖、葡萄糖及柚皮素的含量比较发现依据两种石斛的总多糖含量、水解后的单糖含量与峰面积比值以及柚皮素含量,无法区分铁皮石斛与霍山石斛,需结合其他专属性方法方能对两种石斛进行区别。在生物活性研究方面,李秀芳[6]对霍山石斛和4种药典石斛多糖的降血糖活性进行比较发现,霍山石斛多糖降血糖效果最佳,铁皮石斛和金钗石斛有一定效果,流苏石斛和鼓槌石斛与模型组比较没有显著差异。查学强等[7]对霍山石斛和铁皮石斛多糖清除自由基的能力进行比较,表明霍山石斛多糖具有更高的抗氧化能力。鲍丽娟等[8]对霍山石斛和铁皮石斛水提物对肝癌细胞HepG2的体外活性抑制能力进行比较,表明霍山石斛水提物较铁皮石斛提取物具有更高的抑瘤作用。钱明雪等[9]分析了6 种石斛多糖(霍山石斛、铁皮石斛、流苏石斛、鼓槌石斛、金钗石斛和细茎石斛)抗亚急性酒精性肝损伤的作用,结果表明6 种石斛多糖抗酒精性肝损伤的活性存在不同,其中以霍山石斛最为有效。在抗炎方面,Li等[10]研究霍山石斛在LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞中的抗炎作用,结果表明霍山石斛茎乙醇提取物能显著抑制LPS诱导的NO,TNF-α和IL-1b的产生。Ge等[11]研究表明霍山石斛可抑制香烟烟雾诱导的模型小鼠中的肺部炎症。在针对白内障问题方面,李秀芳等[12]还研究出霍山石斛多糖成分可能通过干预氧化应激途径延缓糖尿病性白内障的发展。针对炎症和抗糖尿病性白内障的研究目前尚未在铁皮石斛的研究中发现。

本文通过比较霍山石斛与铁皮石斛(乐清、云南)3种石斛提取物对体外免疫、抗氧化、细胞氧化损伤、抗肿瘤和抑制α-葡萄糖苷酶活性的影响,明确两者的功效差异,从而提高石斛原料的利用价值,为后期作用机制的研究提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

霍山石斛 九仙尊霍山石斛股份有限公司太平畈种植基地;云南铁皮石斛 龙陵县林源石斛开发有限公司;乐清铁皮石斛 浙江乐清市明森铁皮石斛有限公司;DMEM、RPMI-1640、胎牛血清(FBS)、马血清、2.5%胰蛋白液和alamarBlueTMGIBCO公司;牛血清白蛋白(BSA)、细菌脂多糖(LPS)、青霉素、链霉素、磷酸、sulfanilamide、naphtha、staurosporine、水溶性维生素E、维生素C、ABTS、2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ)、三氯化铁、苯甲基磺酰氟(PMSF)、醋酸盐缓冲液、过氧化氢(H2O2) Sigma公司;α-葡萄糖苷酶酶联免疫分析试剂盒、RIPA裂解液 南京建成生物工程研究所;HepG2细胞、PC12、RAW264.7 中科院细胞所;硫酸、苯酚、葡萄糖、无水乙醇等 均为国产分析纯。

UV-120型紫外-可见分光光度计 上海美谱达仪器有限公司;旋转蒸发仪 巩义市予华仪器有限责任公司;DHG-9146A鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司;Synergy HT 多功能酶标仪、Clarify PC化学发光仪 Bio-TEK公司;3541型CO2细胞培养箱 赛默飞世尔科技(中国);Delta series 生物安全柜 美国Labconco公司;OLYMPUS-IX71显微镜 Olympus公司。

1.2 实验方法

1.2.1 石斛提取物制备 石斛采用常规水提法制备水提物样品:将烘干的霍山石斛、乐清铁皮石斛、云南铁皮石斛粉碎加入20 倍水,每次沸水回流提取2 h,共2次,合并滤液,10000×g离心15 min,收集上清液,减压浓缩至浸膏,60 ℃干燥至恒重,即得到石斛水提物[13],分别命名为霍山石斛提取物、乐清铁皮提取物及云南铁皮提取物。

1.2.2 石斛提取物得率和多糖含量测定 以D-葡萄糖为对照品,采用苯酚-硫酸法测定各样品组分中多糖含量[14]。准确量取1.0 mL 供试品溶液,置具塞试管中,照标准曲线制作方法测定吸光度,根据标准曲线数据和下列公式计算多糖提取率。所获得标准曲线方程为Y=0.0098X-0.0101,R2=0.9985)。

样品提取物得率(%)=提取物的质量(g)×100/药材的质量(g)

式(1)

X=C×v1/2×v2×v3/M

式(2)

式(2)中:X:样品中粗多糖得率(以葡聚糖计),mg/g;C:测试样品的多糖浓度,mg/L;M:样品质量,mg;v1:样品提取液总体积,mL;v2:沉淀粗多糖所用样品提取液体积,mL;v3:样品测定液总体积,mL。

1.2.3 体外刺激巨噬细胞RAW264.7释放NO活性 称取一定量的石斛提取物,于灭过菌的Eppendorf离心管中,在无菌条件下用PBS(pH7.4)配成5 mg·mL-1的溶液,12000×g离心30 min,无菌操作台中将上清转入灭菌管中,再用PBS将样品稀释至0.5、1.0、2.0、5.0 mg·mL-1(作用终浓度为50、100、200 和500 μg·mL-1),参照文献[15]的方法测定巨噬细胞RAW264.7的NO释放量。阳性对照为LPS(10 μg·mL-1),阴性对照为PBS(pH7.4)。

1.2.4 体外抗氧化活性检测

1.2.4.1 ABTS自由基的测定 参照文献[16-17]的方法,取0.1 mL的Trolox标准品或水提物(1、2、4 mg/mL)于试管中,加入3.9 mL ABTS+·稀释工作液,混合10 s并室温下混匀20 min,734 nm波长下测定吸光度,以Trolox为参照制作标准曲线,根据线性方程Y=0.0008X+0.1274(R2=0.9958),计算对ABST自由基的清除效果,计算结果以TEAC值(μmol/L)表示,并以去离子水和0.2 mg·mL-1维生素C为阴性和阳性对照。

1.2.4.2 FRAP法测定总抗氧化能力 参照Benzie等[18]的方法,取100 μL水提物溶液(作用终浓度为1、2、4 mg/mL)与新配置的900 μL FRAP试剂(10 mmol·L-1TPTZ溶液、20 mmol·L-1三氯化铁溶液和300 mmol·L-1醋酸盐缓冲液的体积比1∶1∶10),在37 ℃下混匀并孵育2 h,待孵育结束后,在593 nm处检测吸光度,分别以水和0.2 mg·mL-1维生素C(VC)为阴性和阳性对照。以硫酸亚铁绘制标准曲线,根据线性方程Y=0.001X+0.0348(R2=0.9989),将吸光度值转化对应为FRAP值,即μmol/L。

1.2.5 对H2O2诱导PC12细胞衰老(氧化损伤)的保护作用 参照文献[19-21]的方法,取对数生长期的PC12细胞消化制成悬浮液,用含15%马血清和2.5% FBS的DMEM培养基配制成5×104个/mL的细胞悬液,每孔190 μL接种于96孔板,等细胞贴壁后,加入10 μL 20 mmol·L-1的H2O2处理液,处理4 h后,将培养基吸出,每孔加入199 μL含有血清的DMEM培养液,然后加入1 μL 3种水提物溶液(50、100和200 μg·mL-1)。阳性对照为1 mg·mL-1VC。置于37 ℃和5% CO2培养48 h后,加入180 μL无色培养基和20 μL 0.075 mg·mL-1AlamarBlueTM试剂,培养6～8 h后至阴性对照组颜色由蓝变红时,用酶标仪测定570和600 nm处的吸光度。然后根据Alamar Blue试剂盒提供的公式计算样品对H2O2诱导的PC12细胞增值的影响。计算公式如下:

修复率(%)=[1-117216×A570(样品)-80586×A600(样品)]×100/[117216×A570(对照)-80586×A600(对照)]

1.2.6 体外抑制肝癌细胞HepG2的活性测定 取对数生长期的HepG2细胞消化制成悬浮液,用含10% FBS的DMEM培养基配制成5×104个/mL的细胞悬液,接种于96孔板中,每孔200 μL细胞悬液,在37 ℃和5% CO2培养箱中培养过夜。待细胞完全贴壁后,吸去培养基,分别加入200 μL含不同样品的3种水提物(50、100、200和500 μg·mL-1)DMEM培养基。阴性和阳性对照分别为水和10 μmol/L星形孢菌(Staurosporine)。每个样品做三个复孔,在37 ℃和5% CO2培养箱中培养72 h后吸去培养基,加入180 μL无色培养基和20 μL 0.075 mg·mL-1alamarBlueTM试剂,培养6～8 h后至阴性对照组颜色由蓝变红时,用酶标仪测定570和600 nm处的吸光度。然后根据Alamar Blue试剂盒提供的公式计算样品对HepG2细胞增值的影响。

抑制率(%)=[117216×A570(样品)-80586×Aλ600(样品)]×100/[117216×A570(对照)-80586×A600(对照)]

1.2.7 胰岛素抵抗HepG2模型细胞内α-葡萄糖苷酶活性 参照文献[22-23]的方法,HepG2细胞复苏后以含10%灭活FBS的RPMI 1640培养,细胞贴壁后,将处于对数生长期的细胞消化,以2×104个/mL的细胞浓度将HepG2细胞接种于细胞培养瓶中。待细胞单层贴壁后,加入含1500 IU·L-1胰岛素浓度的正常培养基,于37 ℃和5% CO2培养箱中孵育36 h后,弃去培养基,用PBS(pH为7.4)洗涤1次,再加入正常培养基37 ℃孵育20 min,重复上述过程1次,最后加入正常培养基。胰岛素抵抗组加入正常培养基,阳性对照组加入含1.5 mmol·L-1二甲双胍的正常培养基,样品组分别加入含有3种样品(作用终浓度为100、200、400 μg/mL)的正常培养基,正常细胞组即复苏后用正常培养基培养的细胞,于37 ℃、5% CO2培养箱中孵育24 h,收集细胞到15 mL离心管中,10000 r·min-1离心3 min,弃上清液,用预冷的1 mL PBS洗涤细胞,并重复两次,最后收集细胞于1.5 mL离心管中,吸去PBS溶液上清后,将离心管置于碎冰之中,按照1 mL 1% triton添加10 μL 100 mmol·L-1苯甲基磺酰氟(PMSF)的比例混匀裂解液,5×106个细胞添加400 μL裂解液,4 ℃过夜,裂解后的离心管置于预冷到4 ℃的离心机中,15000 r·min-1离心30 min,将上清液转移到1 mL的离心管中,于4 ℃保存。按照α-葡萄糖苷酶酶联免疫分析试剂盒的方法操作，检测α-葡萄糖苷酶酶活。

1.3 数据处理

采用Excel 2013和SPSS 19.0软件进行数据处理,结果以均值±标准偏差表示;结果采用组间t 检验进行比较,当p<0.05时,差异显著;当p<0.01时,差异极显著。图中仅标注各样品在同一浓度下的显著性,各样品在同一浓度下,不含有相同小写字母,表示差异显著(p<0.05)。

2 结果与分析

2.1 石斛提取物得率和多糖含量结果

由表1可知,霍山石斛提取物的得率最高,达到62.90%,而云南铁皮多糖含量最高,达到57.29%。同时,通过计算能够发现霍山石斛和铁皮石斛茎中的多糖含量均在40%～58%之间,差异不明显。

表1 石斛提取物的得率和多糖含量Table 1 Yield and content of Dendrobium extracts

2.2 体外刺激巨噬细胞RAW264.7释放NO活性分析

巨噬细胞被激活后产生的NO被视为免疫系统重要的信号传导因子,结果如图1所示,霍山石斛提取物能很好地促进RAW264.7释放NO,并呈浓度依赖性,表现出良好的提高免疫活性,而乐清铁皮提取物、云南铁皮提取物免疫活性较弱。

图1 石斛提取物对巨噬细胞Raw264.7释放NO的影响Fig.1 Effects on NO release from RAW264.7 cells of Dendrobium extracts注:图中不同小写字母代表各样品在同一浓度下差异显著,p<0.05),图2～6同。

2.3 抗氧化活性分析

2.3.1 ABTS自由基清除能力 石斛提取物的ABTS自由基清除能力结果如图2所示,随着石斛提取物质量浓度的增加,ABTS自由基清除能力逐渐增强,且呈浓度依赖性。霍山石斛提取物ABTS自由基清除能力显著优于其他样品。

图2 石斛提取物对ABTS自由基清除能力的影响Fig.2 Effects on ABTS radical scavenging ability of Dendrobium extracts

2.3.2 总抗氧化能力(FRAP)分析 FRAP分析广泛运用于食品与保健品的抗氧化能力测定,为验证ABTS自由基模型测定的结果,采用FRAP试验来评价样品的抗氧化能力。如图3所示,当样品质量浓度从1 mg·mL-1增至4 mg·mL-1时,总抗氧化能力FRAP逐渐增强,且呈浓度依赖性。另外,样品的FRAP与清除ABTS自由基的能力具有良好的正相关性,与已有文献[24]报道类似。结合ABTS抗氧化模型的试验结果(图2)可以得出,霍山石斛提取物相较于铁皮石斛提取物具有更好的抗氧化活性。

图3 石斛提取物对总抗氧化能力的影响Fig.3 Effect on total antioxidant capacity of Dendrobium extracts

2.4 石斛提取物对H2O2诱导PC12细胞氧化损伤的保护作用

由活性氧介导的氧化应激损伤在神经退行性疾病中起了至关重要的作用,H2O2是体内代谢产生的一种ROS,能够与多种生物靶标分子(如DNA、蛋白、脂质)反应,可以透过细胞膜,通过多种途径造成线粒体的损伤,导致一系列类似衰老现象出现。如图4所示,不同浓度霍山石斛提取物预处理后,对H2O2诱导PC12细胞氧化损伤的修复率显著优于其他样品,且呈剂量依懒性,在浓度200 μg·mL-1时修复率达到40.52%,可以显著提高细胞活力,具有明显的抗衰老活性。

图4 石斛提取物对H2O2诱导PC12细胞氧化损伤的保护作用Fig.4 Protective effect of Dendrobium extractson oxidative damage in PC12 cells induced by H2O2

2.5 石斛提取物对HepG2细胞增殖抑制的影响

如图5所示,在试验所选浓度范围内,石斛提取物具有一定的抗肿瘤活性,且霍山石斛提取物(500 μg·mL-1)对HepG2的抑制作用最高为22.1%。

图5 石斛提取物对HepG2增殖的抑制作用Fig.5 The inhibition of Dendrobium extractson the proliferation of HepG2 cells

2.6 对胰岛素抵抗HepG2模型细胞内α-葡萄糖苷酶的影响

张超等[22]研究表明,HepG2细胞经过胰岛素诱导发生胰岛素抵抗后,丙酮酸激酶和己糖激酶的酶活相对于正常细胞组明显降低,α-葡萄糖苷酶活出现显著升高,经二甲双胍处理后α-葡萄糖苷酶活出现显著性下降,能够准确模拟药物治疗状态下糖尿病患者的酶活状态。如图6所示,在100 μg·mL-1低浓度时,3种样品均对α-葡萄糖苷酶活无抑制作用;在中高浓度时霍山石斛提取物(200和400 μg·mL-1)具有一定的抑制活性,表明霍山石斛提取物具有较好的抑制α-葡萄糖苷酶酶活的作用。

图6 石斛提取物对α-葡萄糖苷酶酶活的抑制作用Fig.6 Effects on α-glucosidase ability in insulin-resistant HepG2cells of Dendrobium extracts

3 结论与讨论

石斛属植物具有显著的体内、体外抗药理活性。体外活性比较结果表明,霍山石斛相较于铁皮石斛具有更好的提高免疫力、抗氧化、抗衰老、降血糖等生物活性。霍山石斛提取物在低浓度(50 μg·mL-1)时具有良好的提高免疫力活性,而铁皮石斛提取物在试验浓度下基本没有活性。霍山石斛提取物具有更好的ABTS自由基清除能力和FRAP能力,其物质基础有待进一步确认。郝杰等[25]发现霍山石斛多糖(分子量最大的组分S1)具有最强的还原力、抗脂质过氧化能力及清除H2O2和羟基自由基的能力,而霍山石斛中寡糖、多酚、黄酮、缩合单宁等小分子物质也可能具备很好地抗氧化活性。

抗衰老活性分析表明,霍山石斛提取物在浓度200 μg·mL-1时修复率达到40.52%,可以显著提高细胞活力,而两种铁皮石斛提取物的修复率分别为25.29%和29.88%。降血糖结果表明,在中高浓度时霍山石斛提取物(200和400 μg·mL-1)具有较好的降血糖作用,而铁皮石斛提取物基本没有活性。霍山石斛作为一种常用的名贵中药,广泛的药理活性是其成为一种名贵中药的前提[26]。通过体外活性比较分析,对霍山石斛不同生物活性的物质基础有进一步认识,为后期活性物质的筛选、生物活性的作用机制及临床应用提供有价值参考。