超高压和热处理对发酵石榴汁品质的影响

殷晓翠,马 嫄,*,苏 凡,梁智林,罗 鸣,付东旭,车振明,袁乙平,耿越昌,徐 娟

(1.西华大学食品与生物工程学院,四川成都 610039; (2.四川福能源生物科技有限公司,四川成都 610031)

石榴(PunicagranatumL)属于安石榴科,广泛分布于亚洲、非洲、美洲和欧洲南部的温带和亚热带地区[1]。石榴富含多酚类、黄酮、鞣质、花色苷等营养物质,这些物质使石榴具有抗氧化和预防癌症等多种保健作用[2-6]。石榴汁是其主要的加工产品,以石榴汁为原料添加益生菌进行发酵,可以增加石榴汁的营养价值和感官品质,同时有效地保持其功能性成分,是石榴深加工的一条新型途径,有着巨大的市场潜力[7-9]。

采用合适的杀菌技术以保证产品安全和保持产品品质,是发酵石榴汁加工需要解决的重要问题。目前,果蔬汁的杀菌多采用传统的热杀菌方式,但较高的处理温度在杀灭微生物和酶的同时,也造成营养物质的损失,影响产品质量[10-11],如石榴汁褐变度的提高和花色苷含量的下降[11]。超高压技术(High hydrostatic pressure processing,HHP)是一种重要的非热加工技术,是指将密封于弹性容器内的食品置于水或其他液体作为传压介质的压力系统中,经100～1000 MPa压力处理,在常温甚至更低的温度下,达到杀菌、灭酶,保证食品安全并延长货架期等作用[12-13]。超高压技术只作用于非共价键,与传统热杀菌相比,在杀菌的同时能够更好地保持食品的营养价值[14]。目前,超高压已应用于多种果蔬汁的加工中,如草莓汁[15]、蓝莓汁[16]、桑葚汁[17]、石榴汁[18];超高压用于石榴汁加工的研究较少,在发酵石榴汁加工中的应用未见报道,分析其贮藏期内品质变化的报道也不多。

本研究通过比较超高压和热处理(Thermal processing,TP)两种杀菌方式对发酵石榴汁品质的影响,探究发酵石榴汁在4 ℃贮藏过程中的品质变化规律,探讨超高压技术在石榴汁生产中应用的可行性,为超高压技术在石榴汁产业化加工中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

甜石榴浓缩汁(TSS 64.8 °Brix)、酸石榴浓缩汁(TSS 62.3 °Brix)、桑葚浓缩汁(TSS 62.7 °Brix) 四川福能源生物科技有限公司提供;植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌(活菌数≥1.0×1010CFU/g) 四川高福记生物科技有限公司;葡萄酒果酒专用酵母(活菌数≥1.0×109CFU/g) 安琪酵母股份有限公司;白砂糖 成都新纪元食品有限公司;甲醇、没食子酸、芦丁、福林酚等试剂(分析纯) 成都科龙化工试剂公司;平板计数培养基、孟加拉红培养基 北京奥博星生物技术有限责任公司;Trolox(≥98.0%)、1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH)(≥97.0%) 上海源叶生物科技有限公司。

UV-2600型紫外可见分光光度计 尤尼柯(上海)仪器有限公司;G154DWS型高温灭菌锅 上海赛海洋生物科技实业有限公司;A610型全自动折光仪 济南海能股份有限公司;PHS-320型pH计 成都世纪方舟科技有限公司;HPP-5L超高压灭菌设备 包头科发高压科技有限责任公司;单室真空包装机 诸城市兴和机械有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 发酵石榴汁的制备

操作要点:甜石榴浓缩汁与饮用水按照1∶3.6875的质量比进行复原后,65 ℃下巴氏灭菌20 min,装入经121 ℃、20 min高温灭菌的发酵罐。加入12%质量分数为50%的白砂糖糖液,接种1.5%的嗜酸乳杆菌、1.5%植物乳杆菌和0.02%的酵母菌(以复原石榴汁和糖液的总质量计),将发酵罐置于暗处,25 ℃避光发酵48 h。添加酸石榴浓缩汁(100 mL/L)和桑葚浓缩汁(1.11 mL/L),进行口味调配,将调配好的发酵石榴汁分装到聚乙烯袋中,40 mL/袋,采用真空包装机进行封口,暂存于湿度为85%～90% 的4 ℃冷库(不超过2 h),准备杀菌处理。

1.2.2 发酵石榴汁灭菌处理

1.2.2.1 超高压处理 将分装好的样品置于超高压设备中,于室温下进行超高压处理,经过前期预实验,选用600 MPa/10 min为超高压处理条件,并进行杀菌处理。

1.2.2.2 热处理 经过前期预实验,发现在65 ℃处理20 min,可使杀菌效果达到行业标准的要求,保证产品安全且不出现蒸煮味,因此选用65 ℃/20 min为热处理杀菌条件,并进行杀菌处理。

将经过超高压和热处理的样品置于4 ℃冷库中贮藏30 d,每5 d取样测定贮藏期内品质的变化。

1.2.3 指标测定

1.2.3.1 微生物的测定 菌落总数参照GB 4789.2-2016[19]进行测定;霉菌和酵母菌参照GB 4789.15-2016[20]进行测定。

1.2.3.2 pH的测定 采用pH计测定发酵石榴汁的pH。

1.2.3.3 可溶性固形物(TSS)的测定 参照Zou等[17]的方法,使用阿贝折射仪测定,以蒸馏水作为空白,结果以°Brix计。

1.2.3.4 可滴定酸(TA)的测定 参照Varela-Santos等[6]的方法,采用pH电位法测定可滴定酸,模式选择pH8.1。量取10 mL样品,用0.1 mol/L NaOH溶液进行滴定。

1.2.3.5 色泽的测定 采用全自动色差仪在反射模式下对发酵石榴汁的亮度(L*)、红色值(a*)和黄色值(b*)进行测定,根据公式计算总色差(ΔE)。

式(1)

1.2.3.6 总酚含量的测定 参照Di Cagno等[21]的方法,采用Folin-Ciocalteau法测定总酚含量,并略作修改。样品测定:取1 mL稀释样品与0.5 mL Folin-Ciocalteau试剂混合,加入6.5 mL 10% Na2CO3溶液,在室温下置于暗处保持1 h,用分光光度计测量760 nm处的吸光值。总酚含量以每100 mL样品中含有的没食子酸的毫克数表示。

标准曲线的制作参照古小露等[22]的方法:精密量取 0.05 mg/mL 的没食子酸标准溶液0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL,分别置于25 mL 容量瓶中,各加入1.0 mL福林酚试剂和13 mL 10%的Na2CO3溶液,用蒸馏水定容,混匀,室温避光静置60 min,在760 nm处测定其吸光度,以没食子酸溶液浓度为横坐标,吸光值为纵坐标,制作标准曲线,其回归曲线方程为Y=57.928X+0.0207(R2=0.999)。

1.2.3.7 花色苷含量的测定 参照Chen等[23]的方法,采用pH示差法测定总花色苷含量,并略作修改。样品测定:取0.5 mL待测定样品溶液,分别用4.5 mL pH1.0(0.025 mol/L 的KCl)和4.5 mL pH4.5的(0.4 mol/L醋酸钠)缓冲液稀释,混匀后,室温避光静置15 min,以蒸馏水作为对照,分别测定其在510、700 nm下的吸光值。花色苷含量C(mg/L)的计算公式如下。

吸光值A=(A510-A700)pH1.0-(A510-A700)pH4.5

式(2)

式中:Mw:以矢车菊素-3-葡萄糖苷为标准,为449.2;ε:26900;DF:样品稀释倍数。

1.2.3.8 总黄酮含量的测定 参照Wang等[24]的方法,测定总黄酮含量。标准曲线的制作:精确量取0.5 mg/mL芦丁标准溶液0.25、0.30、0.40、0.50、0.60 mL于5 mL容量瓶中,加入2 mL蒸馏水,加入0.15 mL 5% NaNO2溶液,反应6 min后,加入0.15 mL 10%的AlCl3·6H2O溶液,5 min后加入1 mL 1 mol/L NaOH溶液,用蒸馏水补至为5 mL,将上述溶液混匀后,室温避光静置30 min,在510 nm处测定吸光值。以芦丁溶液浓度为横坐标,吸光值为纵坐标制作标准曲线,其回归曲线方程为:Y=2.2037X+0.0005(R2=0.999)。

样品测定:取0.5 mL稀释10倍的样品,于5 mL容量瓶中,按照上述方法,测出吸光度,并根据标准曲线计算相应总黄酮的含量。

1.2.3.9 抗氧化活性的测定 参照古小露等[22]的方法,并略作修改。标准曲线的制作:配制浓度为20～160 μmol/L的 Trolox标准溶液。分别取1 mL 标准溶液与 4.5 mL 100 μmol/L的DPPH甲醇溶液(准确称取7.856 mg DPPH,用甲醇定容至200 mL)充分混合,室温避光放置30 min,于517 nm处测定吸光度(A实验)。对照组用4.5 mL 无水甲醇代替DPPH溶液(A对照),空白组用1 mL 蒸馏水代替样品(A空白),各组平行测定3次,按式(3)计算Trolox 对DPPH自由基清除率。以Trolox 质量浓度为横坐标,DPPH自由基清除率为纵坐标,绘制标准曲线。

式(3)

样品的测定:取1 mL发酵石榴汁按上述方法测定其中的DPPH自由基清除率,抗氧化能力以总酚含量以Trolox当量(TEAC)μmol/L计。

1.3 数据处理

所有实验均重复3次,结果以Mean±SD表示,图片及表格利用SPSS 23.0和Origin Pro 8.6软件进行绘制,不同处理方法间的数据采用Ducan比较方法,显著水平为0.05,并用标记字母法进行标记。采用SPSS进行Person相关系数分析。

2 结果与分析

2.1 超高压和热杀菌处理后微生物数量的变化

表1为超高压和热处理对发酵石榴汁的杀菌效果,图1为杀菌处理后发酵石榴汁贮藏期间菌落总数的变化。如表1所示,未处理的发酵石榴汁菌落总数为1.45×104CFU/mL,经过超高压和热处理后,菌落总数符合《NY/T 434-2016 绿色食品、果蔬汁饮料》[25]对菌落总数≤100 CFU/mL的要求。经过超高压和热处理后,发酵石榴汁中的霉菌和酵母均未检出。由图1可知,在贮藏期内,随着贮藏时间的延长,两种处理组中的菌落总数呈现明显上升趋势,且热处理组的增长速度高于超高压处理组。在30 d时,超高压处理组和热处理组菌落总数分别为55、80 CFU/mL,均低于100 CFU/mL,说明在4 ℃条件下,贮藏时间在30 d内,超高压和热处理均能保持发酵石榴汁安全贮藏。两个处理组发酵石榴汁的菌落总数在贮藏期内增加,可能源于处理后残存微生物在贮藏期内的繁殖,而超高压处理组菌落总数的提高还可能源于超高压引起的亚致死微生物在贮藏期内的复苏及繁殖[26]。Munoz等[27]研究发现,超高压处理可使接种到橙汁、苹果汁和蔬菜汤中的E.coli出现亚致死现象。

表1 超高压和热处理对发酵石榴汁的杀菌效果Table 1 The sterilization effect of fermented pomegranate juice treated by HHP and TP

图1 贮藏期间发酵石榴汁菌落总数的变化Fig.1 Changes of TAB of fermented pomegranate juice during storage

2.2 超高压和热杀菌处理对发酵石榴汁pH、TA和TSS的影响

如表2～表3所示,未处理的发酵石榴汁pH、TA、TSS分别为3.28±0.00、3.64%±0.10%、(21.48±0.00)°Brix。超高压和热处理后,发酵石榴汁的TSS、pH和TA均无显著变化(p>0.05),说明处理方式对发酵石榴汁系统的稳定性影响不显著(p>0.05)。赵凤等[26]研究也发现,超高压和热处理后枸杞汁的TSS、pH和TA无显著性变化(p>0.05),与本文结果一致。在贮藏期间,两种处理的发酵石榴汁的TSS、pH无显著变化(p>0.05),而TA显著下降(p<0.05),这可能是由于贮藏期间,少量微生物代谢产酸和α-羟基酸的链降解反应引起的[23]。

表2 超高压和热处理对发酵石榴汁色泽、pH、TSS、TA、总酚、总黄酮、花色苷和抗氧化活性的影响(n=3)Table 2 Effects of HHP and TP on the color,pH,TSS,TA,total phenols,total flavonoids, total anthocyanins and antioxidant activity in fermented pomegranate juice(n=3)

表3 贮藏期间发酵石榴汁的pH、TSS和TA的变化(n=3)Table 3 pH、TSS、TA variation of fermented pomegranate juice during storage(n=3)

2.3 超高压和热杀菌处理对发酵石榴汁活性成分的影响

2.3.1 总酚含量的变化 总酚是石榴汁中重要的功能性成分。由表2可知,未处理发酵石榴汁中的总酚含量为90.33 mg/100 mL,经超高压处理后其含量显著增加(p<0.05),而热处理则显著降低了发酵石榴汁中的总酚含量(p<0.05)。这与Chen等[23]的研究结果一致。Wang等[24]也研究发现,超高压处理后的桑葚汁中总酚含量高于热处理组。由于酚类物质是热敏性成分,高温可能使之发生降解;而超高压不破坏分子内部共价键,因此超高压对酚类物质的影响相对较小[26]。超高压处理的样品中总酚含量的增加可能是因为加压条件下植物细胞被破坏,某些抗氧化成分的可提取性增加[28]。图2为贮藏期间发酵石榴汁中总酚含量的变化。由图2可知,在贮藏期间,两种处理组样品的总酚含量均呈下降趋势,贮藏期结束时,超高压处理组总酚含量降低了26.01%,而热处理组的总酚含量降低了27.30%,这与Keenan等[29]发现在贮藏期间超高压处理后的果昔中总酚含量高于热处理组的结果一致。酚类物质属于抗氧化成分,其含量在贮藏期间的下降可能是由于样品中的溶解氧所致,这些氧气在贮藏期间通过形成氧自由基,从而使酚类物质发生氧化,并最终使其降解[26]。

图2 贮藏期间发酵石榴汁中总酚含量的变化Fig.2 Changes of total phenols content of fermented pomegranate juice during storage

2.3.2 总花色苷含量的变化 花色苷是石榴汁中重要的呈色物质和功能性成分,大部分以单体形式存在,主要有矢车菊素-3-葡萄糖苷(Cy-3-glu)、天竺葵素-3-葡萄糖苷(Pg-3-glu)和矢车菊素-3-芸香苷(Pg-3-rut)等3种[30]。由表2可知,未处理发酵石榴汁中的花色苷含量为41.30 mg/L,超高压和热处理使发酵石榴汁中的总花色苷含量显著降低(p<0.05),超高压处理组的总花色苷损失量低于热处理组。Patras等[31]研究发现,超高压处理的蓝莓汁和草莓汁中的花色苷含量高于热处理组。图3为贮藏期间发酵石榴汁中总花色苷含量的变化。由图3可知,在贮藏期间,两种处理组的发酵石榴汁中总花色苷含量均呈现下降趋势,与总酚的变化趋势一致。贮藏30 d时,超高压处理组总花色苷减少了40.89%,热处理组总花色苷含量降低了44.27%。这表明超高压处理能更大限度地保留发酵石榴汁中总花色苷的含量。Gao等[32]研究也发现,在贮藏期间超高压处理组草莓汁的花色苷含量下降程度低于热处理组,与本文结果一致。

图3 贮藏期间发酵石榴汁花色苷含量的变化Fig.3 Changes of anthocyanins content of fermented pomegranate juice during storage

2.3.3 总黄酮含量的变化 由表2可知,未处理发酵石榴汁中的总黄酮含量为87.79 mg/100 mL,经超高压处理后其总黄酮含量未发生显著变化(p>0.05),而热处理的发酵石榴汁中的总黄酮含量显著降低(p<0.05)。Wang等[24]也研究发现,超高压桑葚汁中的总黄酮含量高于热处理组。这是由于热处理造成酚类物质降解,从而降低了其总黄酮的含量。图4为贮藏期间发酵石榴汁中总黄酮含量的变化。

由图4可知,在整个贮藏期间,2种处理组的总黄酮含量均呈下降趋势,与总酚和花色苷的变化趋势一致。在贮藏前20 d,超高压处理样品的总黄酮含量高于热处理组,此后,热处理组的总黄酮含量高于超高压处理组,表明随着贮藏期的延长,热处理能更有效控制总黄酮在贮藏期内的损失。Uckoo等[33]研究发现,在贮藏期间热处理能更好地保留葡萄柚汁中的黄酮类物质含量。

图4 贮藏期间发酵石榴汁中总黄酮含量的变化Fig.4 Changes of total flavonoids content of fermented pomegranate juice during storage

2.3.4 抗氧化活性的变化 本研究选用了DPPH自由基清除能力的方法来评价超高压和热处理前、后及贮藏期间发酵石榴汁的抗氧化活性变化。从表2可以看出,HHP处理对发酵石榴汁的DPPH自由基清除能力无显著影响(p>0.05),而热处理显著降低了其DPPH自由基清除能力(p<0.05),表明超高压处理对发酵石榴汁中抗氧化活性的保留率高于热处理组。Dede等[34]研究发现,超高压番茄汁和胡萝卜汁中的抗氧化活性高于热处理组。图5为贮藏期间发酵石榴汁抗氧化活性的变化。由图5可知,在贮藏期间两种处理组的发酵石榴汁中的抗氧化活性均表现出下降的趋势,与总酚、总黄酮及总花色苷的含量变化趋势一致。在贮藏期结束时,超高压处理组石榴汁的抗氧化活性降低了8.47%,而热处理组的抗氧化活性降低了8.72%,表明超高压处理能更好地保持发酵石榴汁在贮藏期内的抗氧化活性。Chen等[23]的研究表明,在贮藏期间超高压处理的石榴汁的抗氧化活性高于热处理组,与本文结果一致。

图5 贮藏期间发酵石榴汁中抗氧化活性的变化Fig.5 Changes of antioxidant activity of fermented pomegranate juice during storage

由于石榴汁中的总酚、总黄酮和总花色苷含量与其抗氧化活性有关,因此本研究还对发酵石榴汁的抗氧化活性进行分析,以探究发酵石榴汁中的总酚、总黄酮和总花色苷与抗氧化活性之间的关系。通过相关性分析研究发酵石榴汁中总酚、总黄酮和总花色苷含量与抗氧化活性之间的关系,结果见表4。由表4可知,在贮藏期间发酵石榴汁的抗氧化活性与总酚、总花色苷和总黄酮含量呈现极显著正相关(p<0.01),表明总酚、总花色苷和总黄酮含量对其贮藏期间的抗氧化活性具有重要贡献,该研究结论与Kalt[35]和Cao[36]的研究结果一致。Kalt等[35]研究发现,鲜草莓、蓝莓和覆盆子在贮藏期间的抗氧化活性与总酚和总花色苷的含量呈极显著正相关(p<0.01)。Cao等[36]也发现,超高压草莓汁在贮藏期间的抗氧化活性与总酚和花色苷的含量极显著正相关(p<0.01),也与本文结果一致。

表4 贮藏期间超高压和热处理发酵石榴汁中总酚、黄酮和花色苷含量与抗氧化活性之间的Pearson相关性分析Table 4 Pearson correlation analysis between antioxidant compounds and antioxidant capacity in fermented pomegranate juice after HHP and TP treatments during storage

2.4 超高压和热杀菌对发酵石榴汁色泽的影响

果蔬汁的色泽是评价产品品质的重要指标。由表2可知,热处理和超高压处理组的ΔE值均低于2,表明两种处理对发酵石榴汁的色泽影响小,未造成视觉差别。该研究结果与Patras等[31]的研究结果一致。由图6(A)、(B)、(C)可知,在贮藏期间两种处理组的L*值和a*值均表现下降的趋势,表明随着贮藏时间的延长,发酵石榴汁的亮度降低,红色变浅,而b*值呈上升的趋势,说明随着贮藏时间的延长,发酵石榴汁的颜色向更黄转变,且热处理组的L*值和b*值的变化程度高于超高压处理组,表明其在贮藏期间的色泽变化更剧烈。超高压和热处理发酵石榴汁在贮藏期间的色泽变化可能与发酵石榴汁中的花色苷含量下降有关[23]。

图6 贮藏期间发酵石榴汁L*、a*、b*的变化Fig.6 Changes of L*,a* and b* of fermented pomegranate juice during storage

3 结论

超高压和热处理后,发酵石榴汁的微生物数量均符合行业标准,且在贮藏期间呈现上升趋势,在贮藏结束时,超高压和热处理处理组的菌落总数分别为55、80 CFU/mL,也符合行业标准要求;pH、TA和TSS在两种处理前、后均无显著变化(p>0.05);在贮藏期内pH、TSS无显著变化(p>0.05),而TA显著下降(p<0.05);超高压处理后的样品具有更高的总酚、总花色苷、总黄酮和抗氧化活性;在贮藏过程中,总酚、花色苷、总黄酮含量和抗氧化活性均呈下降趋势,与热处理相比,超高压能更好地保留总酚、总花色苷含量及抗氧化活性,而热处理能更有效地控制贮藏过程中总黄酮的损失;通过相关性分析发现,样品在贮藏期间的抗氧化活性与总酚、总花色苷和总黄酮含量呈极显著正相关(p<0.01);与未处理组相比,超高压和热处理对发酵石榴汁色泽的影响较小(ΔE<2),在贮藏期间两种处理组的L*值、a*值呈下降趋势,b*值呈上升趋势,且热处理组的变化程度高于超高压处理组。

综上所述,与热处理相比,超高压处理组的发酵石榴汁的总酚、总黄酮、总花色苷和抗氧化性等品质更佳,因此在石榴汁的生产加工过程中可以采用超高压处理或超高压协同热处理,以达到灭菌和保质的目的。