冷鲜牛肉复合保鲜剂的筛选与优化

张杏亚,李 姣,李亚蕾

(宁夏大学农学院,宁夏银川 750021)

我国牛肉产量仅次于美国和巴西,居世界第三位,牛肉人均消费量约5kg,仅为世界均值的1/2,亚洲均值的40%,我国牛肉有较大的发展空间。牛肉具有高蛋白、低脂肪、味道鲜美的特点,深受人们的喜爱。目前,在我国约80%以上的牛肉消费形式都是冷鲜牛肉,由于冷链的不完善,在贮藏、运输和销售过程中易受到外界微生物污染而腐败变质,食用价值降低[1],货架期短,这严重影响了我国牛肉产业的发展。使用保鲜剂是延长冷鲜牛肉货架期的常用方法之一,化学保鲜剂使用早,但存在安全隐患,天然保鲜剂方便安全、保鲜效果好,更利于消费者接受,成为现代保鲜技术研究的热点。

近年来,不少学者以乳酸钠[2]、双乙酸钠、山梨酸钠、抗坏血酸、壳聚糖[3]、乳酸链球菌素[4]、茶多酚[5]、聚赖氨酸及纳他霉素[6]为保鲜剂用于冷鲜肉的保藏,取得了一定的效果。然而,研究者并没有考虑复配保鲜剂之间的协同及拮抗性。本文选用茶多酚、乳酸链球菌素、壳聚糖、聚赖氨酸、纳他霉素及山梨酸钾为保鲜剂,以冷鲜牛肉贮藏中产生的混合菌为研究对象,考察不同保鲜剂对冷鲜牛肉的抑菌效果,在考虑协同及拮抗性的基础上,筛选出适宜的保鲜剂,并用响应面法进行优化复合保鲜剂配方,为冷鲜牛肉保鲜剂的合理使用提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

秦川牛背最长肌 当天屠宰,购自宁夏怀远路口新百超市;茶多酚、壳聚糖、聚赖氨酸、纳他霉素、乳酸链球菌素(食品级) 河南东东化工产品有限公司;山梨酸钾(食品级) 南通奥凯生物技术开发有限公司;氧化镁(分析纯) 烟台市双双化工有限公司;硼酸(分析纯) 西陇化工股份有限公司;次甲基蓝(生物染色剂) 上海中秦化学试剂有限公司;甲基红(指示剂) 西陇化工股份有限公司;醋酸(分析纯)、平板计数琼脂(生化试剂) 银川泰丰生物科技有限公司;营养肉汤(生化试剂) 杭州百思生物技术有限公司。

SW-CJ-2FD超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司;BCD-521WDPW冰箱 重庆海尔制冷电器有限公司;DSX-280手提式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂;BSC-150恒温恒湿箱 上海博讯实业有限公司医疗设备厂;PL203电子天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;YE4A295759移液枪 大龙兴创实验仪器有限公司;96孔酶标板 江苏省海门市博阳实验器材厂;1765半微量定氮蒸馏装置 天长市金桥分析仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 菌悬液的制备 将牛肉密封4 ℃冷藏15 d后,表面已长大量菌斑,发粘、有气泡、恶臭,取5 g腐败肉放入无菌袋中,加入45 mL生理盐水,对肉进行充分全面的清洗揉搓,洗出液则为菌悬液,置于无菌离心管内备用[7-8]。

1.2.2 保鲜剂溶液配制 根据GB 2760-2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》[9]中食品添加剂的最大使用量不同,用无菌蒸馏水溶解聚赖氨酸、乳酸链球菌素、山梨酸钾、纳他霉素、茶多酚,均配制成0.03%的溶液,壳聚糖溶于2%醋酸配成0.1%的溶液。

1.2.3 最小抑菌浓度(MIC)的测定 采用二倍稀释法测定MIC:取无菌96孔平底板,从第1～12列依次加入100 μL营养肉汤培养基(NB),第1列再加入100 μL蒸馏水作为阴性对照,第12列再加100 μL菌悬液作阳性对照,第2列加入相应浓度的保鲜剂100 μL,混匀后吸取100 μL至第3列中,依此类推进行二倍比稀释至第11列,混匀后弃掉100 μL,使稀释后各孔中的受试药物浓度倍比减少,最后于2～11号孔中各加入菌悬液100 μL,4 ℃培养24 h[10]。

评判标准为:有抑菌作用-菌液清澈透明;无抑菌作用-菌液混浊、有沉淀或絮状悬浮物或在液面下或孔壁上形成菌膜[11],将有抑菌作用最低浓度记为MIC。试验设置两个平行,每次试验进行两次验证。

1.2.4 协同拮抗效应指数(FICI)的测定 根据单一保鲜剂MIC测定结果,按棋盘稀释法[12]略作修改进行测定。采取6×6棋盘,根据所测得的每种保鲜剂的MIC值,将每种保鲜剂的最高浓度设定为2×MIC,然后用无菌蒸馏水进行一系列双倍稀释。以纳他霉素和乳酸链球菌素联合使用为例,纳他霉素以横行方式,乳酸链球菌素以纵列方式,将10 μL各自不同浓度的样液加入96孔板中,每孔再加菌悬液90 μL,使96孔板的每1横行孔中乳酸链球菌素浓度不变,纳他霉素浓度则依次为2、1、1/2、1/4、1/8、1/16×MIC;96孔板的每1纵列孔中纳他霉素浓度不变,乳酸链球菌素浓度则依次为2、1、1/2、1/4、1/8、1/16×MIC。将培养板震荡均匀后于4 ℃下静置培养18～24 h,观察结果。计算FICI判定保鲜剂两两复配效果[13]:

FICI=[MIC(A)/MICA]+[MIC(B)/MICB]

其中,MICA和MICB分别代表A保鲜剂和B保鲜剂单独使用时的MIC值,MIC(A)和MIC(B)分别代表A保鲜剂和B保鲜剂联合使用时各自的MIC值。FICI≤0. 5,协同作用;0.52.0,拮抗作用,各组试验进行两次验证。

1.2.5 响应面优化复合天然保鲜剂配方 由最小抑菌浓度(MIC)的测定和棋盘稀释法确定的保鲜剂为单因素,设计四因素三水平响应面优化试验,各因素水平见表1。将保鲜剂涂抹于新鲜牛肉上,0～4 ℃冷藏,进行感官评定、TVB-N值、细菌总数的测定,根据预实验结果,冷藏7 d后腐败开始加剧,以冷藏7 d后牛肉TVB-N值为指标进行分析,筛选出保鲜剂最佳配方。

表1 因素水平设计表Table 1 Factors and levels design table

1.2.6 最佳配方保鲜剂对冷鲜牛肉保存期的影响 分别取5 mL所筛选出来的最佳配方的保鲜剂和无菌蒸馏水涂抹于新鲜牛肉,作为最佳组和对照组,从冷藏第3 h开始,保藏时间记为第0 d,每3 d对其进行感官评定、TVB-N值、细菌总数的测定,探究最佳配方的保鲜效果。

1.2.7 最佳组合对牛肉冷藏期间感官品质的影响 参考GB/T 17238-2008《鲜冻分割牛肉》对牛肉的感官品质要求,按表2打分标准对检测结果进行评分,算总分取平均值为最后综合评分。评分标准为:按 Williams 9 级评分法进行评分:9-极好、8-很好、7-好、6-次好、5-一般、4-一般以下、3-差、2-很差、1-极差,5-可接受。

表2 感官品质评分表Table 2 Sensory quality score table

1.2.8 最佳组合对牛肉冷藏期间挥发性盐基氮值的影响 将试样除去脂肪、骨及腱后,绞碎搅匀,称取约10.0 g,置于锥形瓶中,加100 mL水,不时振摇,浸渍30 min后过滤,滤液置冰箱备用。根据GB 5009.228-2016《食品安全国家标准食品中挥发性盐基氮的测定》中的半微量定氮法进行实验[14]。

从保鲜剂处理之后第3 h开始,保藏时间为第0 d，每隔3 d进行一次挥发性盐基氮含量的测定,试样中挥发性盐基氮的含量按公式(2)进行计算。鲜肉TVB-N含量≤15 mg/100 g,变质肉TVB-N含量>15 mg/100 g[15]。

式(2)

式中:X-样中挥发性盐基氮的含量,mg/100 g;V1-测定用样液消耗盐酸标准溶液体积,mL;V2-试剂空白消耗盐酸标准溶液体积,mL;c-盐酸标准溶液的实际浓度,mol/L;14-与1.00 mL盐酸标准溶液[c(HCL)=1.000 mol/L]相当的氮的质量,mg;m-试样质量,g。

1.2.9 最佳组合对牛肉冷藏期间细菌总数的影响 根据GB 4789.2-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》,变质肉细菌总数>1.0×106cfu/g[16]。

1.3 数据处理

以TVB-N值为响应值,应用软件Design-Expert 8.06中的Box-behnken软件进行优化和设计实验,筛选最佳复合天然保鲜剂配方。并以未经保鲜剂处理的冷藏牛肉为对照,以TVB-N值和细菌总数为检测指标,进行了最佳配比天然保鲜剂对冷藏牛肉保鲜效果的研究。

2 结果与分析

2.1 最小抑菌浓度(MIC)测定结果

参考GB 2760-2014 规定,确定聚赖氨酸、乳酸链球菌素、山梨酸钾、纳他霉素、茶多酚、壳聚糖的最大使用量分别为0.25、0.5、1.0、0.3、0.3、6 g/kg。采用二倍稀释法测定MIC,观察各保鲜剂96孔平板菌液状态,相邻两个孔板菌液清澈、菌液浑浊,菌液清澈的保鲜剂浓度,即为此保鲜剂的最小抑菌浓度。实验结果如表3所示。

表3 6种保鲜剂对菌悬液的MICTable 3 MIC of 6 kinds of preservatives on bacterial suspension

由表3可知,六种保鲜剂对牛肉低温腐败菌的抑菌作用为聚赖氨酸>壳聚糖>茶多酚>纳他霉素>乳酸链球菌素>山梨酸钾。

2.2 协同拮抗效应测定结果

通过观察6×6棋盘MIC值,计算FICI,结果如表4所示。

表4 两种保鲜剂单用和联用作用效果Table 4 The effect of two kinds of preservatives alone and in combination

由表4可知，纳他霉素与乳酸链球菌素、山梨酸钾为拮抗作用,与壳聚糖无关;山梨酸钾与聚赖氨酸为部分协同作用,与乳酸链球菌素、茶多酚为无关作用;纳他霉素、山梨酸钾与其他4种保鲜剂之间联用效果不明显,故排除。聚赖氨酸与乳酸链球菌素、茶多酚、壳聚糖之间均为协同作用,可扩大抗菌谱,所以这四种保鲜剂可用于后续的响应面设计。

2.3 复合天然保鲜剂最佳配方的筛选

表5 响应面设计试验结果Table 5 Response surface design experiment results

2.3.2 响应面方差分析 响应面二次回归方程方差分析见表6。分析结果表明,回归模型的p值<0.0001,该模型显著性极高,失拟差F=4.01,p=0.0965>0.05,表明失拟差项不显著,方程对实验拟合是合适的,方程可以比较准确地预测保鲜剂作用下冷鲜羊肉的TVB-N值变化规律,同时4种保鲜剂对TVB-N值的影响均具有极显著性(p<0.01),且存在着一定的交互作用。

表6 二次回归方程方差分析Table 6 Quadratic regression equation analysis of variance

2.3.3 响应面分析与优化 通过Design-Expert 8.06软件分析,多元回归拟合得出4个因素对冷鲜牛肉的TVB-N值的响应面分析优化结果如图1～图6所示。

图1 聚赖氨酸与乳酸链球菌素交互作用响应面曲线Fig.1 Response surface curve of polylysine and nisin interaction

图2 聚赖氨酸与茶多酚交互作用响应面曲线Fig.2 Response surface curve of polylysine and tea polyphenols interaction

图3 聚赖氨酸与壳聚糖交互作用响应面曲线Fig.3 Response surface curve of polylysine and chitosan interaction

图4 乳酸链球菌素与茶多酚交互作用响应面曲线Fig.4 Response surface curve of nisin and tea polyphenols interaction

图5 乳酸链球菌素与壳聚糖交互作用响应面曲线Fig.5 Response surface curve of nisin and chitosan interaction

图6 茶多酚与壳聚糖交互作用响应面曲线Fig.6 Response surface curve of tea polyphenols and chitosan interaction

各因素间的交互作用的强弱可通过响应面陡峭程度和等高线图的形状反映出来,当交互作用较弱时,响应面越缓,等高线呈现为圆形;当交互作用较强时,响应面越陡,等高线呈椭圆形。优化结果表明AC、AB、BC响应面曲面较陡,其等高线也呈椭圆形,则表明聚赖氨酸与乳酸链球菌素,茶多酚之间的交互作用显著,BD响应面曲面较缓,乳酸链球菌素与壳聚糖的交互作用较弱,TVB-N值随着保鲜剂浓度的增加而发生不同程度的降低,与方差分析结果一致。使用Design-Expert 8.06软件,通过回归方程和响应面分析,得出了复合保鲜剂的最佳比例为聚赖氨酸109.5 mg/kg,乳酸链球菌素258.0 mg/kg,茶多酚152.0 mg/kg,壳聚糖130.0 mg/kg。

2.4 最佳复合保鲜剂对冷鲜牛肉保存期的影响

2.4.1 最佳复合保鲜剂对牛肉冷藏期间感官品质的影响 按Williams 9级评分法最佳组和对照组牛肉在冷藏期间的感官变化如图7所示。

图7 感官评价结果Fig.7 Sensory evaluation results

由图7可知,在肉的冷藏期间,随着保鲜天数的增加其感官品质呈现下降趋势,对照组第6 d评分为5分(可接受),此后牛肉已不再新鲜,保鲜期为6 d;而最佳组第21 d为4.8分,低于5分牛肉已变质，第18 d超过5分为可接受。综上,最佳组相比对照组保质期可达到18 d。

2.4.2 最佳组合对牛肉冷藏期间挥发性盐基氮值的影响 利用GB 5009.228-2016[14]中半微量定氮法检测牛肉冷藏期间的挥发性盐基氮值， 冷鲜肉中的挥发性盐基氮评定标准为:鲜肉TVB-N含量≤15 mg/100 g,变质肉TVB-N含量>15 mg/100 g,最佳组和对照组的检测结果如图8所示。

图8 最佳组对牛肉冷藏期间的TVB-N值的影响Fig.8 Effects of the best group on TVB-N value during beef refrigeration

从图8可以看出,对照组第6 d TVB-N值达14.3 mg/100 g,第9 d成为变质肉,而最佳组第6 d TVB-N值仅为4.4 mg/100 g,直到第21 d TVB-N值达到15.6 mg/100 g才成为变质肉。与对照组相比,最佳组能明显延长牛肉的保鲜期,使保鲜期达到18 d。

2.4.3 最佳组合对牛肉冷藏期间细菌总数的影响 通过平板计数得出最佳组与对照组细菌总数，结果如图9所示。

从图9可以看出,最佳保鲜剂组合对微生物有较大的抑制作用,未使用保鲜剂的空白对照组,第6 d微生物总数为1.06×106cfu/g,已超过国家次新鲜肉的标准。而最佳组到第21 d微生物总数才刚刚达到106cfu/g,因此按照微生物菌落总数来评价,最佳保鲜组合对冷藏牛肉的保鲜期可达18 d,优于巩雪等[4]利用几种保鲜剂对冷鲜牛肉保鲜期的研究。

图9 最佳组对牛肉冷藏期间的细菌总数的影响Fig.9 Effects of the best group on the total bacteria during beef refrigeration

3 结论

本实验通过二倍稀释法测定得到聚赖氨酸(poly-L-lysine,PL)、乳酸链球菌素(Nisin)、山梨酸钾、纳他霉素、茶多酚(Tea Polyphenols,TP)、壳聚糖对冷鲜牛肉腐败菌的最小抑菌浓度分别为73、172、323、157、152、130 mg/kg;通过6×6棋盘稀释法检测,明确了聚赖氨酸、乳酸链球菌素、茶多酚、壳聚糖具有协同抑菌效应。通过响应面试验得出最优配方为聚赖氨109.5 mg/kg、乳酸链球菌素258.0 mg/kg、茶多酚152.0 mg/kg、壳聚糖130.0 mg/kg,将最优配方应用于新鲜牛肉,在冷藏期内与对照组相比可明显延长保质期,控制细菌总数和挥发性盐基氮的增长,同时保质期由6 d延长到18 d。本研究筛选优化出4种保鲜剂,为冷鲜牛肉保鲜剂的合理使用提供技术参考。