田旋花EPSPS基因表达特征及草甘膦对其表达的影响

黄兆峰 白薇薇 周欣欣 黄红娟 姜翠兰 张朝贤 魏守辉

摘要 采用实时荧光定量RT-PCR测定了田旋花不同组织、不同叶龄的EPSPS基因mRNA的相对表达量以及草甘膦对EPSPS基因相对表达量的影响。结果表明：田旋花EPSPS基因在不同组织表达量差异显著，在叶的表达量高于茎和根;该基因在9叶期的表达量最高，是3叶期的1.5倍;在草甘膦处理后，田旋花EPSPS基因的表达量先升高后降低，在处理后24 h达最大值。随草甘膦剂量增加，该基因的表达量升高。研究结果可为深入解析田旋花对草甘膦耐药性机理提供参考。

关键词 田旋花; 草甘膦; EPSPS; 表达

中图分类号： S 482.4， S 451.2

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2018372

5-烯醇式丙酮酸-3-磷酸莽草酸合成酶（EPSPS， EC 2.5.1.19）是莽草酸途径中的关键酶，莽草酸-3-磷酸（S3P）和烯醇式丙酮酸（PEP）在EPSPS的催化下转化为5-烯醇式丙酮酸-3-磷酸莽草酸（EPSP）[1]。草甘膦是目前应用最为广泛的广谱灭生性、内吸传导型除草剂[2]。它的作用方式是抑制EPSPS活性，阻断芳香族氨基酸如色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的生物合成，从而达到除草的目的[3]。由于草甘膦具有高效、低毒、低残留、无污染等优良特性，使其迅速成为耐除草剂转基因作物的首選药剂。随着耐草甘膦转基因作物的大面积种植和草甘膦的广泛使用，抗/耐草甘膦杂草将不断发生与发展，给农田杂草治理带来严峻挑战[45]。到目前为止，全球已有42种杂草对草甘膦产生了抗药性[6]。

杂草对草甘膦的抗药性可以分为靶标抗性和非靶标抗性两方面[7]。其中，靶标EPSPS突变或过表达导致的抗药性占主要部分。

靶标EPSPS突变。草甘膦靶标EPSPS基因关键部位核苷酸被取代，导致氨基酸类型改变，进而引起EPSPS构象发生变化，致使草甘膦与EPSPS结合能力下降，最终导致药效降低[89]。牛筋草Eleusine indica、多花黑麦草Lolium multiflorum的EPSPS 106位氨基酸由脯氨酸突变为丝氨酸（Pro-106-Ser）或苏氨酸（Pro-106-Thr），导致对草甘膦抗药性[1011]。抗草甘膦牛筋草种群EPSPS同时存在102位（Thr-102-Ile）和106位（Pro-106-Thr）两个氨基酸取代，该种群表现出对草甘膦高抗性[1213]。

EPSPS过表达。EPSPS 基因拷贝数增加，过表达的EPSPS提供了充足的酶来满足正常生长发育的需要，从而表现出对草甘膦抗药性[1415]。长芒苋Amaranthus palmeri、意大利黑麦草Lolium perenne ssp.multiflorum、地肤Kochia scoparia等杂草的EPSPS基因在多个染色体上成倍扩增， 这些杂草抗药性均是由于靶标EPSPS过表达导致[1517]。耐草甘膦的狗肝菜Dicliptera chinensis和麦冬Ophiopogon japonicus经草甘膦处理后，EPSPS在转录水平上提高，过表达的EPSPS解除了草甘膦的限制，增加了对草甘膦的耐药性[1819]。

田旋花Convolvulus arvensis L.属旋花科旋花属杂草，该杂草具有庞大的根系，以地下根芽或种子进行繁殖，生命力极强，防除困难[20]。已被联合国粮农组织列为世界上18种危害最严重的杂草之一。同时，田旋花是最早报道的对草甘膦具有天然耐药性的杂草之一[21]，但其耐药性机制至今尚不明确。前期的研究发现田旋花EPSPS并无关键氨基酸位点突变[22]，由于EPSPS过表达是草甘膦抗/耐药性的重要机理之一，为探究EPSPS过表达是否在耐草甘膦田旋花中存在，本试验以田旋花为试材，比较了不同组织EPSPS基因表达差异，分析了不同叶龄田旋花EPSPS基因mRNA相对表达量以及草甘膦对EPSPS基因表达的影响，以期为阐明田旋花对草甘膦耐药性机理提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 供试材料

田旋花种子采自北京市海淀区上庄镇（116°17′E;40°13′N）。种子经80%硫酸浸泡30 min，洗净后清水浸泡24 h，于恒温箱中28℃催芽12 h。选萌发长势相同的种子，每个花盆（8 cm ×10 cm）中播种6粒，置于温室内培养（25℃/22℃，相对湿度40%，光照12 h）。待出苗后2叶期进行间苗，每盆保留4株长势一致的幼苗继续培养。研究EPSPS组织表达差异时，在田旋花子叶完全展开后取子叶样品，在田旋花6叶期时取根、茎和叶（植株顶部第1～3片叶）样品;研究田旋花不同叶龄EPSPS表达差异时，取植株顶部第1～3片叶;研究草甘膦对EPSPS表达影响时， 将田旋花幼苗培养至6叶期，用不同剂量的草甘膦461.25、922.5、1 845 g/hm2进行茎叶喷雾处理，分别在处理后12、24、36和48 h取样，取植株顶部第1～3片叶（约200 mg），取样后用液氮迅速冷冻，放入-80℃冰箱中保存备用。每个样品或处理设生物学重复3次。

1.2 引物设计与合成

根据NCBI（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/）登录的田旋花EPSPS （EU698030）和18S rRNA（AJ236013.1）基因序列设计两对特异性引物EPSPS-f 和EPSPS-r及18S rRNA-f和18S rRNA-r（表1）。上述引物由北京六合华大公司合成。

1.3 田旋花总RNA提取及cDNA的合成

按照离心柱式植物总RNA提取试剂盒（天根生化科技公司）的说明提取田旋花不同组织及草甘膦处理后叶片的总RNA。凝胶电泳检测合格后，用于cDNA的合成。以总RNA为模板，用RT-PCR试剂盒（TaKaRa）反转录得到cDNA，于-20℃保存备用。

1.4 荧光定量PCR分析EPSPS表达

采用ABI7500 实时定量 PCR 仪，以cDNA 为模板，按照SYBR Green PCR Master Mix使用说明进行PCR扩增。反应体系为：12.5 μL 2 ×SYBR Green，1 μL cDNA，0.5 μL引物，补水至总体积25 μL。反应程序为：95℃ 15 s，62℃ 25 s，30个循环。反应结束后分析荧光值变化曲线和熔解曲线。Ct值取平均值。以ΔΔCt 法来计算EPSPS的表达量。18S rRNA在不同组织及草甘膦处理后表达稳定，故该基因被选作内参基因[22]。

1.5 数据统计与分析

试验数据采用SPSS数据分析软件进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 田旋花不同组织EPSPS基因表达特征

以田旋花根、茎、叶和子叶为试验材料，测定了EPSPS基因在不同组织的表达特征。如图1所示，EPSPS基因在田旋花不同组织中表达量差异显著。在叶中表达量最高，显著高于在其他组织中的表达量，其次是茎和子叶，在根中的表达量最低。EPSPS基因在茎和子叶中的表达量与在根中的表达量差异也达显著水平。

2.2 EPSPS基因在田旋花不同叶龄表达特征

田旋花在不同叶龄分别取顶部第1～3片叶用于EPSPS基因表达量检测。结果如图2所示，田旋花EPSPS基因在3、6、9、12叶期表达量有差异。在9叶期的相对表达量最高，是表达量最低的3叶期的1.5倍，EPSPS基因在田旋花9叶期和12叶期的表达量差异不显著。

2.3 草甘膦处理对田旋花EPSPS基因表达的影响

以不同剂量草甘膦处理过的田旋花叶片（6叶期时顶部第1～3片叶）为试材，利用实时荧光定量PCR分析了草甘膦对EPSPS基因表达的影响。结果显示，田旋花EPSPS基因在草甘膦（922.5 g/hm2）处理后呈先升高后降低的趋势，在处理后24 h时表达量达到最高，约为未处理时的12倍，之后逐渐下降（图3）。随着草甘膦剂量的提高，田旋花EPSPS基因表达呈增加趋势。

3 讨论

目前，化学除草仍是世界各国防控杂草的主要方式之一。过度依赖化学除草不但造成抗药性杂草的发生和发展，而且会对生态环境产生负面影响。在倡导农药减量、环境保护和绿色发展的背景下，如何防控抗药性杂草的发生和发展是当前杂草科学研究的重要内容。而阐明杂草对除草剂抗药性的内在机制，尤其是解析杂草对世界第一大除草剂草甘膦的抗/耐药性机制是杂草抗药性研究的首要任务。

为阐明田旋花对草甘膦的天然耐药性机制，作者在前人研究的基础上推测田旋花对草甘膦耐药性可能与靶标EPSPS基因过表达相关。植物不同器官对芳香族氨基酸的需求是不同的，而芳香族氨基酸是莽草酸途径中的产物，EPSPS酶是莽草酸途径中的关键酶，因此EPSPS基因在不同组织器官中的表达量可能不一致[23]。本研究利用荧光定量方法对田旋花EPSPS基因在不同组织中的表达模式进行了分析。结果表明，EPSPS基因在田旋花根、茎、叶和子叶均有表达，说明EPSPS基因的表达不具有组织特异性。这一结果与在薤白[24]中EPSPS的表达相一致。田旋花EPSPS基因在叶中表达量最高，在陆地棉[23]中也得到了同样的结果。

在外界因子胁迫下，植物体感受外界胁迫信号而启动或关闭某些基因的表达，以抵御逆境的危害，保证植物细胞的正常生理功能和植物体生长发育。研究表明：植物体内EPSPS基因的过量表达可以提高对草甘膦的耐受性[1517]。棉花品系Y18在受到草甘膦的脅迫作用时，植物体内的EPSPS酶表达量呈现增加的趋势[25]。Shyr等[26] 发现，胡萝卜在含有草甘膦的培养基上培养，EPSPS基因的转录水平明显增加。此外在狗肝菜和麦冬等杂草中均发现了草甘膦处理导致EPSPS基因表达上调的现象[1819]。但是，长芒苋的EPSPS基因表达不受草甘膦处理的影响[15]。本研究表明：草甘膦处理可以引起田旋花EPSPS表达量的提高，并且随着草甘膦剂量的增加，EPSPS表达量也升高，这可能是田旋花对草甘膦耐药性的分子机制。

基因的表达调控受启动子和转录因子调节。田旋花在草甘膦处理后，EPSPS基因上调表达可能与启动子顺式作用元件或相关转录因子有关。从EPSPS基因启动子和转录因子入手探究田旋花耐草甘膦更深层次的机理将是下一步研究重点。

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（責任编辑：田 喆）