MSM人群早期梅毒合并HIV感染NK和DC细胞数目的研究

汪晓丹,张 明,李 娟,翁文佳,高艳青

(1首都医科大学附属北京佑安医院皮肤科,北京 100069;*通讯作者,E-mail:gyqing2001bj@sina.com)

20世纪以来随着HIV/AIDS的流行及其他危险因素的增多,如静脉吸毒、男男性接触(men who have sex with men,MSM),梅毒合并HIV的感染率越来越高。以色列一项研究[1]发现虽然抗病毒治疗已推广,但HIV在MSM者的感染率仍在攀升,相应的梅毒在MSM HIV感染者中的患病率也在升高。梅毒与HIV感染的免疫反应均较复杂,本研究尝试从固有免疫细胞NK、DC着手,初步探索梅毒合并HIV感染的相互作用,为HIV合并梅毒患者的临床诊断、治疗提供进一步理论基础。

1 材料与方法

1.1 研究对象

研究对象均来自2009-2014年首都医科大学附属北京佑安医院性病艾滋病诊疗中心随访的MSM队列人群。其中26例早期梅毒患者(包括一期、二期梅毒、早期潜伏梅毒,且不伴HIV感染),18例HIV感染者(外周血CD4≥350个/μl,感染HIV时间>6个月),18例早期梅毒合并HIV患者(外周血CD4≥350个/μl,感染HIV时间>6个月)。收集病例过程中不包括年龄小于18岁、孕妇或合并有活动性肺结核的患者。所有梅毒患者均未进行驱梅治疗,所有HIV感染者均未进行高效抗逆转录病毒疗法(highly active antiretro-viral therapy,HAART)治疗。选择MSM队列中性别和年龄相匹配的未暴露于HIV和梅毒的20例健康者作为对照。四组入选得一般情况见表1。

表1 四组患者的基线资料

组别病例数年龄(岁)梅毒分期(例)基线RPR一期梅毒二期梅毒早期潜伏梅毒≤1∶41∶8-1∶32>1∶32CD4计数(个/μl)HIV载量(copies/ml)健康组2036(24-53)--------早期梅毒组2631(24-42)481411132--HIV组1829(19-44)------436(359-530)30920(1294-1157417)合并组1833(20-48)35103132410(351-623)45621(460-266000)

表中的数据为中位数(范围),“-”为未做

1.2 方法

1.2.1 Ficoll-Hypaque密度离心法分离PBMC 健康对照组采集新鲜血。取新鲜采集的EDTA抗凝全血离心(TGL-16G台式离心机,北京六一仪器厂)去除血浆后,用PBS稀释一倍,加至淋巴细胞分离液上层,2 500 r/min,离心25 min,取中间白膜层(即单核细胞和淋巴细胞富集层),PBS洗涤2遍,得到外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)。早期梅毒组、HIV感染组、早期梅毒合并HIV感染组均为冻存PBMC,于42 ℃恒温水浴锅(北京中兴伟业仪器有限公司),快速晃动冻存管,使冻存的细胞在1 min内解冻。

1.2.2 荧光抗体染色 利用荧光抗体染色,MutilTestCD 3FITC/CD16+CD56 PE/CD45 PerCP/CD19 APC(美国BD公司),CD3 PerCP,CD4 APC,CD123 PE,CD11C APC(美国eBioscience公司)。选择CD3-CD16+CD56+来界定NK细胞,利用CD123 PE标记pDC,利用CD11c APC标记mDC。

1.2.3 流式细胞仪检测 采用FACSCalibur型流式细胞仪(美国BD公司),分析早期梅毒组、HIV感染组、早期梅毒合并HIV感染组及健康组外周血中NK细胞、DC细胞数目。

1.3 数据统计分析

2 结果

2.1 四组间NK细胞的比较

分析HIV感染者、早期梅毒患者、早期梅毒合并HIV感染者及健康人外周血中NK细胞，结果表明,合并组的NK细胞比率(13.82%±3.36%)比健康对照组(34.30%±4.25%)明显降低(P<0.05),其余各组间比率均无明显差异(见图1)。

与健康组比较，*P<0.05图1 NK细胞在四组人群中的比较 (*P<0.05)

2.2 四组间DC细胞的比较

分析HIV感染者、早期梅毒患者、早期梅毒合并HIV感染者及健康人外周血中DC两个亚群mDC和pDC所占比率的差异，结果显示，HIV感染组mDC比率(3.50%±0.47%)明显低于早期梅毒组(12.47%±1.53%,P<0.001)、合并组(7.79%±0.48%,P<0.05)、健康组(5.36%±0.57%,P<0.05);早期梅毒组明显高于健康组(P<0.05),其余组间比率均无明显差异。pDC在四组间未发现差异(见图2)。

与健康组比较，*P<0.05;与HIV组比较，#P<0.05,##P<0.001图2 mDC和pDC在四组人群中的比较

3 讨论

因为传播途径相似,梅毒和HIV感染相互促进。梅毒下疳或其他皮损局部的树突状细胞、自然杀伤细胞和T细胞有利于HIV全身播散[2]。此外,梅毒感染可使外周血HIV病毒载量升高,CD4数目下降,从而增加HIV传播给其他性伴侣的概率[3]。梅毒免疫反应极其复杂,病理生理研究表明,梅毒不仅仅是由于毒性或炎症物质释放造成的简单急性炎症反应,梅毒皮损中占主导地位的是单核巨噬细胞,而非急性炎症的多核白细胞。目前认为梅毒的免疫是一种迟发型变态反应,它的效应T细胞产生的细胞因子在梅毒螺旋体的清除过程中起重要作用。然而,HIV作为一种免疫缺陷病毒,可引起细胞免疫严重受损,人们推测HIV感染或许可以改变机体针对梅毒螺旋体的感染免疫。研究发现在21.8%有梅毒症状的HIV梅毒共感染患者中观察到皮肤外非典型临床表现,包括眼部、胃肠道等症状[4]。推测处于免疫缺陷状态时,梅毒可能会加速进展,甚至出现所谓的“恶性梅毒”[5]固有免疫作为机体免疫的第一道防线,在疾病的发生和进展过程中起重要作用,我们分别检测了HIV感染者、早期梅毒患者、早期梅毒合并HIV感染者及健康人的NK、DC细胞,以此初步探索梅毒合并HIV感染相互作用的特点。

3.1 NK细胞与梅毒

NK细胞是免疫系统的第一道防线,在适应性免疫启动之前,就可发挥免疫效应。它可分泌细胞因子INF-γ、TNF-β等,通过NK-INF-γ-巨噬-IL-12这一固有免疫网络,维持Th1在梅毒感染中的优势状态[6]。NK细胞作用机制主要是通过激活凋亡酶系统以及表达抑制性受体来平衡其在机体中的免疫作用[7]。目前关于NK在梅毒患者的研究主要集中在功能和外周血的数量。多数研究认为梅毒患者NK细胞功能下降,即抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)及INF-γ、TNF-α分泌能力下降,且这种下降与梅毒病程迁延有关。但Jensen等[8]对25例早期梅毒患者,包括一期、二期和隐性梅毒患者治疗前后分析发现,NK细胞活性与梅毒分期有关:一期梅毒血清转阳之前NK细胞功能升高,而在二期或隐性梅毒血清转阳之后,NK细胞活性下降。并发现NK细胞活性下降与血清中的循环免疫复合物相关,通过阻滞与Fc受体的结合,减弱了NK细胞的ADCC作用。关于NK细胞在外周血的数量,国内外研究研究较少,目前无较为一致的观点。Cruz等[9]第一次发现梅毒患者外周血NK细胞总量下降,但无功能的CD56negativeCD16brightNK细胞却升高。CD56negativeCD16brightNK细胞ADCC活性及INF-α、TNF-α分泌能力均较差,一般多在难以控制的病毒感染中升高。

3.2 NK细胞与HIV感染

在HIV感染中,关于NK细胞较为一致的结论为:NK细胞的功能如ADCC,细胞因子分泌下降,无功能性的NK细胞亚群即CD56negativeCD16brightNK异常升高,NK细胞的总量变化不大。Madhavi等[10]研究发现，HIV感染慢性期ADCC活性低的CD56negativeCD16brightNK细胞异常增多,并在抗病毒治疗后恢复。推测这部分无功能性NK细胞可能与CD4恢复不良及免疫重建不良有关[11]。有研究认为NK细胞在组织的重新分布造成了其外周血数目的减少[12]。

本研究对早期梅毒组、HIV感染组、梅毒合并HIV感染组与健康对照组进行比较,发现合并组NK细胞明显低于健康对照。而HIV感染组、早期梅毒组NK细胞均未发现明显减少。或许是由于合并HIV感染后,大量出现无功能的NK细胞亚群即CD56negativeCD16brightNK,所以外周血CD16+CD56+NK相应减少。

3.3 DC细胞与梅毒

DC是功能最强的专职性抗原提呈细胞,是联接固有免疫与适应性免疫的“纽带”,在梅毒感染中,DC另一个重要的作用是免疫调节功能。它的两个亚群mDC和pDC可对不同抗原表达产生不同的细胞因子,mDC通过合成和分泌IL-12促进Th细胞向Th1分化;pDC不分泌IL-12,可使Th细胞向Th2分化。在梅毒“Th1向Th2漂移”现象中起调节作用。对四组样本的比较发现:早期梅毒患者外周血CD11c+mDC细胞高于正常人,而CD123+pDC细胞与正常人无显著差异。提示梅毒螺旋体在机体内促使DC向mDC分化,Th1反应增强,引起细胞免疫;而pDC无明显增多,Th2型反应未见明显增强,提示体液免疫在梅毒病程中的作用较弱。

3.4 DC细胞与HIV

DC在发挥早期免疫作用的同时,也是HIV感染的靶细胞和储存场所。HIV感染后外周血和组织中的DC数量往往大幅减少,功能下降。CD123+的pDC为DC主要亚群,能分泌INF-γ,抑制HIV病毒复制,增强T细胞、单核细胞的功能,是固有免疫抗HIV感染的重要组成部分。DC在抑制与清除HIV的同时,也可能促进HIV病毒在体内播散。DC细胞表面有CCR4、CCR5、CXCR4等受体,这些都是HIV侵入细胞的辅助受体。因此,DCs在HIV感染中的作用始终存在争议。有学者对长期无进展者(long term nonprogressors,LTNPs)、正常进展的HIV感染者以及AIDS患者进行分析,发现LTNPs者pDC显著升高,而AIDS显著降低,且外周血的pDC数目与HIV病毒载量呈负相关,pDC数目减少与机会性感染有关[13,14]。但亦有学者报道HIV感染后DC的数量和功能未发生改变[15,16]。Zhang等[17]发现经过60周抗病毒治疗(ART)后,典型慢性HIV感染者的mDC始终低于长期无进展者,推测mDC或可保护HIV感染者免于进展至AIDS。为了更好地描述其免疫状态,本研究选取CD4≥350个/μl,感染时间>6个月的典型慢性HIV感染者,结果发现,HIV感染患者中mDC与其他三组相比均降低,而pDC无明显变化，与Zhang等[17]研究结果一致。合并组mDC高于HIV感染组,或许与HIV患者感染早期梅毒后机体Th1反应增强,mDC相应升高,“中和”HIV感染对mDC的消耗有关。梅毒和HIV感染均以细胞免疫为主,故pDC介导的体液免疫在以上不同患者组间未发现差异。

本研究从固有免疫NK、DC细胞着手初步探索梅毒合并HIV感染相互作用的特点。发现梅毒合并HIV感染者在一定程度上增加了机体固有免疫系统的损耗,促进了梅毒的进展。但梅毒与HIV感染的免疫反应极为复杂,固有免疫仅为人体免疫的第一道防线,未来仍需要更多的研究来探索适应性免疫,以彻底阐明梅毒合并HIV感染的免疫状态。