免疫磁性微球的制备及形态表征

王鼎文，姚尧，张爱琳,3，张华

（1.天津科技大学省部共建食品营养与安全国家重点实验室，天津 300457；2.天津农学院食品科学与生物工程学院，天津 300384； 3.天津市农副产品深加工技术工程中心，天津 300384）

0 引言

纳米磁性微球从诞生开始，它就受到了科研工作者的关注。曹君剑等[1]用纳米磁粉为内核，用反相乳液法制备壳聚糖磁性复合微球，并用戊二醛活化复合微球并交联鼠抗人CD3 单克隆抗体，成功制备出人CD3 纳米免疫磁性微球；马力等[2]采用反相悬浮包埋法制备免疫磁性微球，并对产物的结构、粒径、磁性能进行了表征，还成功在其表面包埋了葡萄球菌蛋白；解泉源[3]把SiO2包裹的CdTe QDs作为生物标记物与免疫球蛋白偶合，吸附到电极上制成超灵敏免疫传感器。本文采用化学共沉淀法制备纳米磁性微球，运用XRD 分析其纯度及形态结构，并对其进行氨基化修饰和表面包埋蛋白，以期为免疫磁性微球的研究开发和应用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

1.1.1 主要试剂

小鼠血清；牛血清白蛋白（生化试剂）；无水乙醇、硫酸亚铁（FeSO4·7H2O）、三氯化铁（FeCl3·6H2O）、过氧化氢、25 %戊二醛、吐温-20；3-氨丙基三乙氧基硅烷。

1.1.2 仪器与设备

D/max-2500/PC 型X-射线衍射仪；S21-2 恒温磁力搅拌器；磁分离架；SHZ-82 恒温震荡器；电热鼓风干燥箱[4,5]。

1.2 方法

1.2.1 磁性微球无水乙醇溶液的制备

按照摩尔比分别为1:2、1.5:2、1.75:2 的比例分别称取三份的FeSO4·7H2O 和FeCl3·6H2O，加入200 mL 蒸馏水搅拌溶解混匀；70 ℃条件下超声5 min，高速搅拌，滴入0.75 mol/L 的NaOH 溶液250 mL，高速搅拌30 min；置于磁分离架上，弃上清，无水乙醇洗2 次，制备出纳米磁性微球溶液，冷冻干燥12 h，得到纳米磁珠粉末[6,7]。

1.2.2 磁性微球表面氨基化修饰

向制备液加APTES溶液0.4 mL，24 ℃振荡交联7 h；用磁分离器将APTES 修饰磁性微球分离，取制备完成的硅烷化的Fe3O4纳米磁珠无水乙醇溶液0.5 mL，分离弃清液，再加入2 mL 5 %戊二醛溶液，24 ℃振荡交联2 h，分离弃清液，冷冻干燥得到氨基化纳米磁珠粉末。

1.2.3 免疫磁性微球的制备

将小鼠血清与磁性微球进行不同比例的稀释，恒温振荡器上25 ℃振荡交联100 min。

1.2.4 免疫磁性微球的形态表征

形态结构采用X-射线衍射法（XRD）[8-10]，测试条件：工作电压35 kV，电流20 mA，衍射角扫描范围：10°-90°。

2 结果与分析

2.1 纳米Fe3O4 微球的外观及磁响应性分析

三种不同摩尔比的Fe2+和Fe3+采用化学共沉淀法制备出的纳米磁性微球溶液；得出磁性微球n（Fe2+）∶n（Fe3+）=1.75:2 的磁性相对于另外两个更强。

2.2 纳米Fe3O4 微球氨基化修饰后浓度

表1 纳米Fe3O4 磁性微球氨基化修饰后称重结果（2 mL/管）

由表1 可计算，制备出的纳米磁性微球的浓度为9.15 mg/mL,经过氨基化后的纳米磁性微球的浓度12.85 mg/mL。

2.3 免疫磁性微球的形态表征结果比较分析

采用X 射线衍射法进行免疫磁性微球的形态表征，将所得结果与Fe3O4、Fe2O3、FeO 的PDF 标注卡进行对比。

2.3.1 样品中n(Fe2+)∶n(Fe3+)为1:2 时形态表征结果分析

当 样 品 中n(Fe2+) ∶n(Fe3+) 为1:2 时 共 出 现10 个峰，其中分别出现在衍射角位于30.06°、35.42°、62.70°的3 个衍射峰为最强峰，但是在衍射角位于43.08°、57.14°两处也出现比较强的峰，因此可确定，使用此比例制备的纳米磁性微球中大部分为Fe3O4粉末，但也有比较明显的杂质成分出现。

2.3.2 样品中n(Fe2+)∶n(Fe3+)为1.5:2 时形态表征结果分析

样 品 中n(Fe2+) ∶n(Fe3+) 为1.5:2 时， 共 出现10 个衍射峰，其中出现在衍射角位于30.18°、35.58°、62.80°的3 个衍射峰为最强峰，这与Fe3O4的粉末衍射卡片（PDF）标准卡片标注的X 射线衍射的衍射角和强度基本一致。

2.3.3 样品中n(Fe2+)∶n(Fe3+)为1.75:2 时形态表征结果分析

当 样 品 中n(Fe2+) ∶n(Fe3+) 为1.75:2 时，共出现9 个衍射峰位置，其中出现在衍射角位于30.14°、35.56°、62.84°的3 个衍射峰为最强峰，这与Fe3O4的粉末衍射卡片（PDF）标准卡片标注的X 射线衍射的衍射角和强度基本上是一致的；因此可确定，使用此比例所制备的纳米磁性微球中大部分为Fe3O4。按照Fe2+和Fe3+的摩尔比值是1.75:2 所制备免疫磁性微球Fe3O4的含量依旧是最多的。

3 结论

本研究采用化学共沉淀法制备纳米Fe3O4磁性微球，并进行氨基化修饰和结合免疫蛋白，成功制备出具有免疫磁性的Fe3O4微球。经磁响应性检验分析得出，所制备的纳米免疫磁性微球具有超顺磁性；化学共沉淀法制备出纳米磁性微球溶液的浓度为9.15 mg/mL，经氨基化修饰后的纳米磁性微球溶液的浓度12.85 mg/mL；经X 射线衍射进行形态表征分析得出，按照Fe2+和Fe3+的摩尔比值是1.75:2 相对于另外两个比例所制备的纳米免疫磁性微球纯度要更高。