黄连碱改善脂肪肝SD大鼠模型的效应及机制研究

王妮华 王琼熠 范辉

摘要目的：观察黄连碱对脂肪肝SD大鼠模型脂代谢指标的影响，探讨作用机制。方法：采用高脂饲养构建SD大鼠脂肪肝模型，随机分组为正常对照组、高脂模型组、黄连碱低、高剂量组（10 mg/kg、50 mg/kg），给药30 d，分析大鼠体重、肝指数、三酰甘油（TG）、肝功能（ALT，AST）及肝脏病理等指标;采用人肝癌HepG2细胞系，蛋白免疫印迹法（WB）观察黄连碱对AMP活化蛋白激酶（AMPK）蛋白的表达，反转录荧光定量PCR（RTPCR）方法分析肉碱脂酰转移酶1（CPT1）mRNA、羟甲基戊二酰辅酶A（HMGCoa）mRNA的表达，高效液相色谱（HPLC）测定细胞内AMP的含量。结果：与高脂饮食组比较，黄连碱低、高剂量组均降低了TG水平、改善AST以及肝脏组织学形态，且黄连碱高剂量组效果优于低剂量组。在HepG2细胞中，黄连碱显著提高AMP的浓度，激活AMPK蛋白磷酸化表达，上调CPT1 mRNA的表达，抑制HMGCoa mRNA的表达。结论：黄连碱具有显著改善大鼠脂肪肝的效应，作用机制可能与提高AMP的浓度，激活AMPK信号通路有关。

关键词黄连碱;脂肪肝;AMP;AMPK

中图分类号：R285.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.01.010

黄连碱（Coptisine，COP）是毛茛科植物黄连中含季铵基团的异喹啉类生物碱，有抗菌、抗炎[12]等多种生物活性[34]。黄连生物活性碱的调脂研究主要集中于小檗碱，其调脂效应和机制是目前中药单体成分中最深入的，小檗碱已被证明是通过线粒体呼吸链途径间接上调AMP和ADP含量，激活AMPK[5]，进而促进脂质氧化利用[67]。我们研究发现COP和小檗碱是黄连生物碱中的肝细胞高亲和成分，且COP细胞亲和性优于小檗碱[8]。COP是否与小檗碱具有相同的降脂活性和作用机制有待探讨。本课题研究以AMPK信号通路为主轴，在体内模型上研究COP降脂活性的效应，在体外层面探讨其可能的降脂分子机制。现报道如下。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1动物与细胞SD大鼠，雄性，平均体重（170±20）g，广东省实验动物中心供应;实验期间饲养室温度为（20±2）℃，湿度为（60±5）%。

人肝癌HepG2细胞株，购自中国科学院上海细胞库。细胞培养：高糖DMEM完全培养液含有10%FBS、1%的双抗（100 U/L青霉素、100 mg/L链霉素）。将细胞置于5%（φ）CO2的37 ℃细胞孵育箱中培养，每2 d换液1次;待细胞生长至约80%，用0.25%胰酶消化细胞，进行传代。

1.1.2药物COP，纯度≥95%，四川中药标准中心供应，批号：130220;高脂饲料（胆固醇2%，猪油10%，胆盐0.3%，蔗糖20%，基础饲料67.7%）广东省实验动物中心供应。

1.1.3试剂与仪器高糖DMEM培养基（美国GIBCO公司，生产批号：1290007）;血清（美国赛默飞世尔公司）;胰酶（北京鼎国昌盛生物技术有限公司，生产批号：89010440）;三酰甘油（TG）试剂盒、谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所，生产批号分别为：2013010038、20130608、20130608）;BCA蛋白定量试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司，货号：110808）;ECL化学发光试剂盒（Advansta，货号：11083115）;蛋白marker：（Thermo，生产批号：00113439）;引物序列由Invitrogen公司合成。色谱纯甲醇（美国Honeywell公司&德国Merck公司）;实验用水为超纯水;其余试剂为分析纯（天津市科密欧化学试剂有限公司）。UC6型超薄切片机（奥地利，Leica儀器有限公司）;H600型透射电镜（日本日立电子有限公司）。SWCF1FD超净台（上海博迅实业有限公司医疗设备厂），CO2细胞培养箱（美国，Thermo Scientific公司）;倒置显微镜（日本，Olympus公司）;Mithras LB 940酶联免疫检测仪（德国，Berthold Technologies公司）;5180R低温高速离心机（德国，Eppendorf公司）HAL100荧光倒置显微镜（德国，Zeiss公司），实时PCR扩增仪（ABI，Stepone Plus），热循环PCR仪（Aplied Biosystems），Ultimate 3000 HPLC仪（美国，Dionex公司），配备DAD检测器;Dionex Acclaim 120 C18色谱柱（4.6mm×250 mm，5 μm）;PURELAB Ultra GE MK2纯水仪（ELGA，High Wycombe，UK）;BT224s型万分之一电子天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司）。

1.2方法

1.2.1分组与模型制备动物实验：将SD大鼠随机分为正常对照组（正常组）（n=6）和观察组（n=18），分别用普通饲料及高脂饲料饲养。42 d造模成功后，观察组随机分成高脂模型组（模型组）、COP低剂量组（10 mg/kg）和COP高剂量组（50 mg/kg），每组6只。体外细胞实验：HepG2细胞培养于高糖DMEM完全培养液中，将实验细胞随机分成空白对照组及COP低剂量组（5.0 mg/kg）、高剂量组（25.0 mg/kg）。

1.2.2给药方法动物实验：COP低、高剂量组分别给予浓度为10 mg/kg、50 mg/kg的COP，1次/d，正常组给予等容量的0.5%CMCNa，连续灌胃给药30 d。细胞实验：当HepG2细胞长到80%～90%，以每孔2×105的细胞个数接种于6孔板，正常培养48 h，细胞达到对数生长期时分组给药，空白对照组给予含10%FBS的完全培养基，观察组中COP低、高剂量组分别予含COP 5.0 μg/mL、25.0 μg/mL的培养液，每组做6个平行孔。

1.2.3检测指标与方法

1）体重及肝指数测定：实验期间称量大鼠体重1次/周。实验结束前，采血后快速摘取肝脏并称取其质量，计算肝指数（肝湿重/体重×100%）。

2）部分血清指标测定：按试剂盒提供的方法测定：磷酸甘油氧化酶PAP法测定血清TG含量，用赖氏法测定ALT含量，比色法测定血清AST含量。

3）肝脏三酰甘油测定：称取肝组织500 mg，加三氯甲烷：甲醇（1∶1）混合液后匀浆，待试剂挥发后用磷酸甘油氧化酶PAP法测定肝脏中TG含量。

4）肝脏病理结构检查：肝组织常规石蜡包埋、切片、HE染色。对肝脏脂肪变性程度及炎性反应程度进行分级、评分，非酒精性脂肪性肝病的病理组织学诊断参考2010年中国肝脏病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组修订的《非酒精性脂肪性肝病诊疗指南》。

5）HPLC法测定细胞ATP、ADP、AMP含量：HepG2细胞提取：取培养皿的细胞首先用冰PBS洗涤两次，立刻转移到一个1.5 mLEP管中。加入冰预冷的1 mL 0.4 mol/L高氯酸，于超声波细胞粉碎机中粉碎、匀浆;离心，取上清液，用5 mol/L的KOH调pH值至6.0～7.0，取上清，用0.22 μm滤膜过滤，待测。色谱条件：流动相：100 mmol/L磷酸盐缓冲液（含12 mmol/L磷酸氢二钠和88 mmol/L磷酸二氢钠，PH=6.5）：甲醇（99.9∶0.1），柱子：C18;柱温：30 ℃;流速：1.0 mL/min;进样量：30 μL;检测波长：254 nm。

6）蛋白印迹分析：提取细胞总蛋白，按BCA试剂盒用酶标仪在570 nm波长下测定蛋白浓度。进行定量及样品前处理后，根据碧云天BCA试剂盒说明书配制胶体（4%的积层胶，12%分离胶），将事先计算好的上样量加入胶体中，以80 V电压电泳30 min左右，再加至120 v电泳90 min后，将胶体上的蛋白转印至PVDF膜中，染色观察蛋白是否顺利转印至PVDF膜中。用TBST将脱脂奶粉配制成5%浓度，将转印后目的蛋白的PVDF膜进行封闭2 h，随后用TBST进行洗涤3次，5 min/次。将PVDF膜置于化学发光成像仪上，滴入ECL发光液显影，随后进行图像采集。

7）PCR法检测分析：细胞中加入1 mLTrizol充分反应后按照说明书进行细胞总RNA提取，用Primer5.0软件设计引物，由Invitrogen公司合成，以20 μL逆转录反应体系合成cDNA。样品在PikoReal上运行96实时qPCR检测系（ThermoFisher）引物序列CPT1上游：5′GCCGCTCGTTCACTCCA3′;下游：5′AGCCGCAGATGTCAATCCC3′;HMGCOA：上游：5′TAACTCAGAGGGTTAAGAT3′;下游：5′ACTGCCAGAGGGAAAC3′。

1.3统计学方法采用SPSS 17.0软件对分组数据进行统计分析，采用多重比较检验和χ2分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1高脂饲料建立脂肪肝的SD大鼠模型实验过程中各组大鼠均无死亡发生。与正常对照组大鼠比较，高脂饮食组大鼠性情温顺，不喜动，毛发蓬乱无光泽，大便稀软，且次数较正常对照组少。造模六周后，进行分组给药，给药约第二周，COP组的大鼠较模型组活跃，饲料摄入量与模型组相当。

2.2COP对脂肪肝大鼠模型体重、肝功能的影响与正常对照组比较，高脂饮食组大鼠体重增长均较快，各给药组的体重增长速度在给药第二周后缓慢，慢于模型组的体重增加速度，但最终体重比较，差异无统计学意义（P>0.05）。与高脂饮食组比较，COP低、高剂量组的肝重、肝指数均降低，差异有统计学意义（P<0.05）。见图1。与正常对照组比，高脂饮食组血清TG、ALT和AST水平均升高，差异有统计学意义（P<0.05），表现为高三酰甘油血症和典型脂肪肝特点;与模型组比较，各给药组血清TG水平降低，COP改善了肝酶ALT、AST水平（P<0.05）。見图2。

2.3COP对脂肪肝大鼠模型的肝脏病理影响肝脏组织TG含量的变化与正常对照组比较，高脂饮食组肝脏组织TG含量较高，与模型组比较，各给药组有显著改善（P<0.05）。见图3。肝脏组织学形态及HE染色病理的变化与正常对照组比较，高脂饮食组肝脏肿大，重量增加，边缘钝而厚，表面色泽苍白，肝脏形态呈显著脂肪变性征状，切片出现大量脂肪空泡，表现为大泡性空泡，模型组表现为中重度的肝脂肪变性特点。与模型组比较，各给药组组织形态仍呈一定的肝脂肪变性特征，且仍然存在脂肪空泡，但具有明显恢复迹象，脂肪空泡转变为小泡性脂肪，且脂肪空泡减少。见图4。

2.4COP对HepG2细胞ATP、ADP、AMP的影响采用高效液相色谱技术建立了测定HepG2细胞内ATP、ADP、AMP含量的方法，用标准曲线定量，蛋白测定校正分析，结果显示：与空白对照组比较，给药组的AMP含量有明显升高趋势;COP高剂量组的细胞EC值较空白对照组显著降低（P<0.05）。见表1、图5。

图6低、高剂量COP对高脂饮食大鼠AMPK蛋白磷酸化水平、CPT1 mRNA、HMGCoa mRNA水平的影响注：（A、B）各组HepG2细胞AMPK蛋白磷酸化水平;（C）各组HepG2细胞CPT1 mRNA水平;（D）各组HepG2细胞HMGCoa mRNA水平，与正常对照组比较，*P<0.05

2.5COP对HepG2细胞AMPK磷酸化、CPT1 mRNA和HMGCoa mRNA水平的影响采用p

AMPK蛋白表达/AMPK蛋白表达率评价AMPK激活程度。与空白对照组比较，COP低、高剂量组均可促进AMPK蛋白磷酸化水平（P<0.05）。见图6A、6B。与空白对照组比较，低剂量COP组CPT1 mRNA表达水平有上升的趋势，但不具有显著性差异，而高剂量COP组CPT1 mRNA表达水平上升，差异有统计学意义（P<0.05）。见图6C。AMPK的激活，可抑制下游HMGCoa的表达，减少胆固醇的生成[9]。与空白对照组比较，高、低剂量COP组均有降低HMGCoa mRNA表达水平的趋势。见图6D。

3讨论

脂肪性肝病（Fitty Liver Disease，FLD）是一种病变主体在肝小叶，以肝细胞弥漫性脂肪变的临床病理综合征。其特点是脂肪堆积，本质是机体能量过剩或脂质异位蓄积于肝，主要表现为肝脏实质细胞脂肪变性。中医药研究集中在活性中药单体化合物，如小檗碱[10]，人参皂甙[11]，和齐墩果酸[12]，试图通过药物激活提高肝脏细胞能量代谢车间的运作效率。最近COP的药物活性也引起了关注，抗心肌缺血[13]，抗糖尿病[14]，抗菌[15]，治疗肝癌和白血病[16]等活性先后被报道[1718]。COP与小檗碱的结构相似，均具有季铵活性基团[19]。COP是黄连中的降脂活性成分，前期的研究发现COP体外降脂活性优于小檗碱。本实验证明了COP对高脂饲养的大鼠脂肪肝具有较好的治疗作用，且COP高剂量组治疗效果优于低剂量组。

研究发现，肝脏脂质代谢是一个复杂的网络调节系统，一些重要的转录和代谢调节因子是整个网络调节的关键节点，如：PPARα、SREBP1c、AMPK。调控这些关键靶点可以帮助肝脏加速分解代谢，从而治疗脂肪肝[20]。AMPK处在调控脂质代谢网络的上游，当感受到细胞能量物AMP/ATP变化时，AMPK的磷酸化增强，可引起脂代谢调节因素的级联反应[21]。并且AMPK在哺乳动物细胞能量平衡及细胞分化中发挥重要作用，其活化后能影响很多脂质代谢相关酶，如HMGCoA、CPT1[22]。本实验中采用WB和RTPCR方法探索COP降脂的机制，结果证明COP改变了HepG2细胞内的能量物质ATP，ADP，AMP的比例关系，降低了细胞EC值，进而诱导AMPK蛋白的磷酸化，以及上调下游β氧化关键酶CPT1的mRNA的表达和下调HMGCoAmRNA的表达。这些结果均提示我们：COP降脂的途径可能与激活AMPK信号通路途径有关。

综上所述，通过体内动物水平研究证实了COP的治疗脂肪肝效果显著，具有降脂的功效，COP在体外HepG2细胞中，既有激活AMPK磷酸化的直接证据，又有激活AMPK信号通路的间接证据，降低了胆固醇合成酶HMGCoa mRNA的表达，促进了脂肪酸β氧化CPT1 mRNA的表达。我们的研究提示COP可能通过激活AMPK信号通路来改善大鼠脂肪肝。

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（2018-12-10收稿责任编辑：王杨）