HPLCDAD法测定八味茵术颗粒剂中6,7二甲氧基香豆素、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ的含量

陆麟 王卓君 戈大春 钱浩良

摘要目的：探讨八味茵术颗粒剂中6，7二甲氧基香豆素、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ的含量测定方法。方法：选取DIKMA Diamonsil C18（2）色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱温30 ℃，DAD检测（200～400 nm）：6，7二甲氧基香豆素的检测波长为340 nm，白术内酯Ⅲ的检测波长为220 nm，白术内酯Ⅰ的检测波长为275 nm。进样量为5 μL，流动相为水（A）乙腈（B）梯度洗脱，流速为1 mL/min。结果：6，7二甲氧基香豆素在0.1～100.0 μg/mL范围内线性关系良好（R2=1.0000）、白术内酯Ⅲ在0.1～100.0 μg/mL范围内线性关系良好（R2=1.0000）、白术内酯Ⅰ在0.1～100.0 μg/mL范围内线性关系良好（R2=1.0000），其精密度、稳定性、加样回收率均符合含量测定要求。结论：本方法简单易行，准确可靠，可有效用于八味茵术颗粒剂的质量控制。

关键词八味茵术颗粒剂;6，7二甲氧基香豆素;白术内酯Ⅲ;白术内酯Ⅰ;高效液相色谱;含量测定

中图分类号：R284文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.01.012

八味茵術颗粒剂为我院的自拟协定处方，经过多年临床使用，疗效确切，由茵陈、生白术、茯苓、苍术、黄芩、淡竹叶、泽泻、栀子9味中药组成。主要的功效是健脾利湿。临床用于皮肤科湿疮、湿疹，对于脾失健运的胃肠道症状，如胃纳差、恶心腹胀、大便溏泄等也具有很好的效果。方中茵陈清利湿热、利湿，白术健脾益气、燥湿利尿，共为君药，行健脾利湿之功，在我院皮肤科得到广泛应用。为了更好的控制该制剂的质量，选用高效液相色谱法进行含量测定，选用方中君药的有效成分6，7二甲氧基香豆素，白术内酯Ⅲ和白术内酯Ⅰ作为指标性成分。

1仪器与试药

1.1仪器

Sartorius BT125D电子天平（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司）;SHIMAZU LC2030C 3D高效液相色谱仪（日本SHIMAZU公司）;HWS26型电热恒温水浴锅（上海一恒科学仪器有限公司）;DZF6050MBE型真空干燥箱（上海精密实验设备有限公司）;AC220240V超声波清洗机（深圳深华泰超声洗净设备有限公司）。

1.2试剂

6，7二甲氧基香豆素（中国药品生物制品检定所，批号：111740200702）;白术内酯Ⅲ（中国药品生物制品检定所，批号：111978201501）;白术内酯Ⅰ（中国药品生物制品检定所，批号：111975201501）;乙腈[高效液相色谱法（HPLC），MERCK，德国];甲醇（HPLC，MERCK，美国）。

1.3分析样品

八味茵术颗粒（自制，批号：171203、171225、180402）。本品为浅棕色或棕色颗粒状，气微，味苦。粒度、含水量、颗粒溶化性均符合《中华人民共和国药典》2015年版的规定。

2方法与结果

2.1色谱条件

DIKMA Diamonsil C18（2）色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱温30 ℃，DAD检测（200～400 nm），流速为1 mL/min，进样量为5 μL，流动相为水（A）乙腈（B）梯度洗脱，0～10.0 min，55% MPB，10.0～25.0 min，55%～95%MPB，25.0～25.1 min，95%～55%MPB，25.1～30.0 min，55%MPB。理论板数按3种标准品6，7二甲氧基香豆素、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ峰计算应不低于3 000。对照品和样品的色谱图见图1。

2.2对照品溶液的制备

取6，7二甲氧基香豆素、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含1.0 mg的溶液。精密量取1 mL，置10 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，0.45 μm滤膜滤过，即得。

2.3供试品溶液的制备

精密量取八味茵术颗粒20.0 g，置20 mL具塞锥形瓶中，加入25 mL甲醇：水（1∶1），室温超声提取15 min，过滤，取续滤液5 mL，转移至50 mL容量瓶中，加流动相定容至刻度，摇匀，即得含量测定的样品溶液。

2.4专属性试验精密吸取6，7二甲氧基香豆素、白术内酯III、白术内酯I对照品溶液，按2.2.2项下的色谱条件进行测定;精密量取八味茵术颗粒适量，按照2.2.1供试品溶液的制备项下制备样品溶液，依照2.2.2项下的色谱条件进行测定，建立各样品的特征图谱，理论板数按3种标准品6，7二甲氧基香豆素、白术内酯III、白术内酯I峰计算应不低于3 000。对照品和样品的色谱图见图1。

2.5线性关系考察

精密称取6，7二甲氧基香豆素、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ对照品适量，分别配成浓度为0.1 μg/mL、0.3 μg/mL、1.0 μg/mL、3.0 μg/mL、10.0 μg/mL、30.0 μg/mL、100.0 μg/mL的溶液，分别精密吸取上述各对照品溶液5 μL，按2.1项下的色谱条件测定，以6，7二甲氧基香豆素、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ对照品的浓度（μg/mL）为横坐标，以峰面积（A）为纵坐标绘制标准曲线，计算得回归方程。见表1。其标准曲线见图2～4。

2.6中间精密度试验

取按照2.2和2.3项下制备八味茵术颗粒的样品溶液，连续进样5次，记录峰面积A，计算6，7二甲氧基香豆素、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ浓度的RSD值。测定结果表明6，7二甲氧基香豆素、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ的进样精密度良好。见表2。

2.7供试品溶液稳定性试验

按照2.2和2.3项下操作，制备八味茵术颗粒的样品溶液，进样分析。于4、8、12、24 h后分别再次进样分析，记录并比较6，7二甲氧基香豆素、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ含量的变化，评价样品溶液中6，7二甲氧基香豆素、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ室温放置不同时间的稳定情况。测定结果表明6，7二甲氧基香豆素、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ在室温放置24 h之内稳定性良好。见表3。

2.8重复性试验

按照2.2和2.3项下操作，制备八味茵术颗粒的样品溶液，进样分析。平行测定6份，记录峰面积A，计算6，7二甲氧基香豆素、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ浓度的RSD值。测定结果表明重复性良好。见表4。

2.9回收率试验

取八味茵术颗粒2.0 g，精密称定，置20 mL具塞锥形瓶中，加入20 mL甲醇：水（1∶1），室温超声提取15 min，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，过滤，取续滤液进行HPLC测定，得到样品中6，7二甲氧基香豆素、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ的含量A mg。

取八味茵术颗粒2.0 g和相应对照品B mg，精密称定，置20 mL具塞锥形瓶中，加入20 mL甲醇：水（1∶1），室温超声提取15 min，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，过滤，取续滤液进行HPLC测定，得到样品中6，7二甲氧基香豆素、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ的含量C mg。平行3份。见表5。

2.10样品测定结果

分别称取制备的3批八味茵术颗粒，按照2.2和2.3项下操作，制备八味茵術颗粒样品溶液，进样分析。见表6。

3讨论

八味茵术颗粒剂为基于中医药理论而成的纯中药制剂，由茵陈、生白术、茯苓、苍术、黄芩、淡竹叶、泽泻、栀子等8味中药组成。白术和茵陈为方中君药。白术对消化体统、免疫系统、泌尿系统有多种药理作用[110]，比较明确的是白术有健脾益气、调节胃肠运动的功能的特点，能够使唾液淀粉酶活性增强、对肠管功能进行调节、对肠管吸收具有促进作用，有实验证明白术内酯Ⅰ为健脾的有效成分[11]。茵陈利湿退黄，同样具有多种的药理作用[1217]，主要体现在保肝利胆、调节免疫、抗病原微生物等方面，其中6，7二甲氧基香豆素有利尿、降低胆固醇和三酰甘油之功效[1819];由于中药复方成分复杂，干扰因素多，因此需要一个简单可行的含量测定方法来监测八味茵术颗粒的质量，虽然有时中药复方中有效成分往往不是含量最高的，有的甚至很难检测到，为含量测定带来难度，如白术内酯Ⅰ，预实验选用RIGOL的HPLC基本检测不到，但是白术的内酯类成分是活性成分，最后选用SHIMAZU LC2030C 3D的HPLC进行含量测定，以君药茵陈、白术中的有效活性成分作为含量测定的指标性成分。

查阅有关白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ和6，7二甲氧基香豆素含量测定的文献[2024]，并且结合预实验的数据发现白术内酯Ⅲ在220 nm波长处有最大紫外吸收，白术内酯Ⅰ在220 nm波长处的紫外响应却很低，但是在275 nm处有最大吸收;而6，7二甲氧基香豆素在275 nm波长处几乎没有紫外吸收，在340 nm波长处有最大紫外吸收，首先选择了检测波长切换的方法对其进行含量测定：0～5.0 min检测波长为340 nm，5.01～12.0 min检测波长为220 nm，12.01～30.0 min检测波长为275 nm，但是最终得到的液相图谱基线不稳定，于是最终确定HPLCDAD全波长扫描法对其进行含量测定。

预实验同样对提取溶剂和提取时间的选择进行了考察。提取溶剂选择了甲醇：水（1∶1）、甲醇和水3种，提取方式选择超声，分别考察了颗粒剂在15 min，30 min和45 min的3种有效成分的提取率，指标性成分对于提取溶剂的敏感度各不相同：6，7二甲氧基香豆素在纯甲醇中几乎没有被提取，白术内酯Ⅲ在水中提取率最高，但白术内酯Ⅰ在水中提取率最低。指标性成分对于提取时间的敏感度也各不相同：白术内酯Ⅲ在水中提取率随时间延长而增加，但是在甲醇中却随时间延长而降低;6，7二甲氧基香豆素不管在何种溶剂中其提取率均随时间的延长而降低;白术内酯Ⅰ在水中提取率不随时间变化，但在甲醇中提取率随时间延长而增加，却在甲醇：水（1∶1）中随时间延长而降低。故综合考虑，最终选择甲醇：水（1∶1）作为提取溶剂，提取时间为15 min。

预实验对含量测定的流动相和色谱柱进行了简单的考察。流动相选择了乙腈和不同浓度的磷酸水溶液（0.05%，0.1%，1.0%）梯度洗脱，基本无差异，故最后选择比较简单的乙腈水作为流动相。色谱柱首先选择Phenomenx Luna C18（2）色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），白术内酯Ⅲ和白术内酯Ⅰ能得到有效分离，峰形良好，但是6，7二甲氧基香豆素无论何种流动相，峰形都不理想，后来改为DIKMA Diamonsil C18（2）（4.6 mm×250 mm，5 μm）的色谱柱，3种指标性成分的峰形和分离情况都良好，故色谱柱选择DIKMA Diamonsil C18（2）。

通过对八味茵术颗粒的性状、粒度、含水量、溶化性、含量测定等研究，建立了其质量标准的方法，通过控制方中活性成分的白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ和6，7二甲氧基香豆素的含量，为八味茵术颗粒的药效指标及临床疗效的重复性和稳定性提供了保障，也为中试产品的质量标准建立奠定了方法学基础。利用DAD检测器建立多波长高效液相色谱法，可在同一色谱条件下利用不同检测窗口实现多类组分、多个成分的同时定性、定量测定，提高了效率。该方法简单易行，准确可靠，可有效用于八味茵术颗粒剂的质量控制。

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（2018-06-06收稿责任编辑：杨觉雄）