扶正抗癌方对Lewis肺癌荷瘤小鼠肺癌基因Bcl2、抑癌基因Bax及血管内皮生长因子、表皮生长因子受体、金属蛋白酶表达的影响

周婷婷 茆俊卿 张传名 陈永昶 张蕾 陈静

摘要目的：观察扶正抗癌方对小鼠Lewis肺癌抗转移机制的影响。方法：选取C57BL/6小鼠50只，雌雄各半，每只小鼠腋窝下接种肿瘤细胞0.2 mL造模，24 h后，完全随机分为对照组、顺铂组、扶正抗癌方低、中、高剂量组，每组10只。分别给药21 d后取出完整肿瘤组织称重计算抑瘤率，同时用实时荧光定量PCR检测Lewis肺癌组织Bcl2和Bax mRNA的表达，免疫组化检测Lewis肺癌组织基质金属蛋白酶9（MMP9）蛋白的表达，用蛋白质印迹法（WB法）检测Lewis肺癌组织血管内皮生长因子（VEGF）、表皮生长因子受体（EGFR）的表达。结果：与模型组小鼠比较，扶正抗癌方药可以呈剂量依赖性抑制Lewis肺癌荷瘤小鼠肿瘤生长，显著升高Lewis肺癌组织中Bax mRNA表达，降低Bcl2 mRNA、MMP9蛋白表达，与模型组比较，差异有统计学意义（P<0.05），其中高剂量组在升高Lewis肺癌组织中Bax mRNA表达、降低Bcl2 mRNA表达方面与顺铂组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。同时模型组Lewis肺癌组织中VEGF、EGFR表达显著升高，扶正抗癌方药可显著降低Lewis肺癌组织中VEGF、EGFR表达，与模型组比较，差异有统计学意义（P<0.05），与顺铂组比较，无统计学意义（P>0.05）。结论：虽然扶正抗癌方总体上较顺铂作用偏弱，但依然能有效抑制肺癌细胞增殖，抑制肺癌细胞Bcl2基因的表达，激活Bax的高表达，下调肺癌细胞中VEGF、EGFR、MMP的表达。

关键词扶正抗癌方;肺癌;抗转移机制;Bcl2;Bax;基质金属蛋白酶;表皮生长因子受体;血管内皮生长因子

中图分类号：R289.5;R734文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.01.016

非小细胞肺癌（NSCLC）属于肺癌的一种，世界卫生组织根据肺癌的生物学、治疗及预后将其分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌，其中NSCLC占所有肺癌的80%以上[1]。近年来肺癌的发病率不断增高，已成为全球癌症死亡的主要原因之一，每年有超过100万的人口死于该病[2]，而大部分患者在确诊时已是晚期，失去了手术机会，总体预后差。针对晚期NSCLC，中国晚期原发性肺癌诊治专家共识（2016年版）[3]指出其治疗原则应以全身治疗为主，局部治疗为辅，首先获取肿瘤组织，明确病理分型和分子遗传学特征，根据检测结果确定治疗方案，以期改善症状、提高患者生命质量。目前推荐采用化疗联合靶向药物维持治疗，但化疗药物具有毒性累积的不良反应，而耐受性较好的分子靶向药物却有费用昂贵的缺点，且仅针对特定基因表型或临床特征的患者[4]，因而仍处于探索阶段。而通过多年的研究摸索，中医药具有明确的肿瘤病灶稳定率高，症状改善率高，不良反应轻微，带瘤生存期延长，能提高患者生命质量的特点[5]。故本研究使用C57BL/6小鼠腋窝下接种肿瘤细胞造模，观察扶正抗癌方对小鼠Lewis肺癌的抗转移机制。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1动物选取C57BL/6小鼠，50只，SPF级，由南京市江宁区青龙山动物繁殖场提供，实验动物使用许可证号：SCXK（苏）20170001。给药前后，小鼠分笼饲养，每笼5只，喂以全价颗粒鼠饲料（南京协同生物工程有限公司），自由饮水饮食，室温20～25 ℃，每天人工光照射12 h，室内通风良好，实验室相对湿度：65%～70%。

1.1.2药物扶正抗癌方（党参10 g、白术10 g、茯苓10 g、山药10 g、陈皮6 g、木香10 g、砂仁6 g、生地黄10 g、黄精15 g、丹参10 g、野葡萄根10 g、灵芝10 g、藤梨根10 g、白花蛇舌草30 g、甘草6 g。）由揚州市中医院提供。顺铂（齐鲁制药有限公司，批号：6A002A88）。

1.1.3试剂与仪器试剂：DNA Marker[天根生化科技（北京）有限公司，批号：M2202];Thermo Scientific RevertAid First cDNA Synthesis Kit（Thermo Fisher Scientific，批号：00306196）;PCR预混合MIX[天根生化科技（北京）有限公司，批号：N2728];SYBR Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）（大连宝生物科技有限公司，批号：A650t1）;VEGF Rabbit Antibody（proteintech，批号：190031AP）。EGFR Rabbit Antibody（proteintech，批号：189861AP）。山羊抗兔二抗（proteintech，批号：SA000012）。仪器：分析天平[塞多利斯科仪器（北京）有限公司，型号：BSA124S];烘箱[巴姆（上海）测控技术有限公司，型号：1012AS];蒸馏水制水器（上海亚荣生化仪器厂，型号：SZ97A）;超纯水机（上海和泰仪器有限公司，型号：MasterD UVF）;石蜡切片机（金华市益迪医疗设备厂，型号：YD1508A）;光学显微镜（蔡司公司，型号：Axioplan 2 imaging）;水浴锅（郑州博科仪器设备有限公司，型号：HW5L）;立式压力蒸汽灭菌器（上海华线医用核子仪器有限公司，型号：HX11L120）;PCR仪（杭州朗基科学仪器有限公司，型号：A300）;RTPCR仪（杭州安杰思生物科技有限公司，型号：AFD9600）;微量分光光度计（杭州奥盛仪器有限公司，型号：Nano100）;横向电泳槽（上海天能科技有限公司，型号：HE120）;凝胶成像系统（上海天能科技有限公司，型号：1600）;高速低温离心机（Thermo Fisher Scientific，型号：MicroCL 17R）。

1.2方法

1.2.1分组与模型制备1）分组：C57BL/6小鼠接种24 h后，随机分为5组，对照组，扶正抗癌方低、中、高剂量组，DDP组。每组10只。2）Lewis肺癌动物模型的建立：液氮冷冻的小鼠Lewis肺癌瘤株于37 ℃水浴中复苏后，先接种于3只C57BL/6小鼠腹腔，10 d后，按无菌操作程序，取荷瘤小鼠腹水，经生理盐水洗涤后，调整细胞浓度为2×106个∕mL的瘤细胞悬液，台盼蓝染色观察记录活细胞数（>95%），取C57BL/6小鼠雌雄各半，6～8周龄，体重18～22 g共50只，在每只小鼠腋窝下接种肿瘤细胞0.2 mL。

1.2.2给药方法对照组：生理盐水0.4 mL灌胃，2次/d×21 d;扶正抗癌方低、中、高剂量组，给药剂量：低剂量组15 g/kg、中剂量组30 g/kg、高剂量组60 g/kg（分别相当于60 kg成人临床用量的5倍、10倍、20倍），分别灌胃含生药0.5、1.0、2.0 g/mL的药液0.3 mL，2次/d×21 d;顺铂组：顺铂按2 mg/kg剂量给药，用生理盐水配成10%浓度，0.4 mL腹腔注射，隔日1次×14 d;接种后第21天，颈椎脱位法处死小鼠，检测相关指标。

1.2.3检测指标与方法1）抑瘤率：颈椎脱位法处死小鼠，取出完整肿瘤组织称重，计算抑瘤率。抑瘤率=（对照组平均瘤重-观察组平均瘤重）∕对照组平均瘤重×100%。2）实时荧光定量PCR检测Lewis肺癌组织Bcl2和Bax mRNA的表达。Trizol法提取Lewis肺癌组织RNA，参考Thermo Scientific RevertAid First cDNA Synthesis Kit试剂盒说明书进行逆转录实验，引物序列PPLBax F：CGAGTGTCTCCGGCGAATTG，PPLBax R：ATGGTGAGCGAGGCGGTGAG，PPLbcl2 F：GGTACCGGAGAGCGTTCAGT，PPLbcl2 R：CTGCTGCATTGTTCCCGTAG;参考SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒说明书进行RTPCR实验，相对定量结果仪器自带软件自动计算。3）免疫组化检测Lewis肺癌组织基质金属蛋白酶9（MMP9）蛋白的表达：Lewis肺癌浸蜡与包埋、切片、抗原修复、苏木精染色、脱水、透明和封片，普通光学显微镜下，观察染色后的载玻片，拍照后，使用Image pro plus统计各个图片中蛋白阳性表达的平均吸光度A值。4）蛋白质印迹法检测Lewis肺癌组织VEGF、EGFR的表达。冰上裂解Lewis肺癌组织，手持式匀浆器匀浆，匀浆后BCA法测定各样本的蛋白浓度，根据蛋白浓度计算各样本电泳时的上样量。使用10%预制十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）凝胶，上样本后以恒压110 V进行凝胶电泳，电泳结束后，以恒压120 V进行湿法转膜，转膜后牛奶封闭，之后孵育第一抗体，4 ℃过夜，清洗后孵育第二抗体2 h，凝胶成像系统化学发光成像，保存数据为图片，应用Quantity One对各条带进行分析，计算出相对值后导出Excel表格做进一步统计。

1.3统计学方法采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，符合正态分布的采用t检验，不符合正态分布的采用秩和检验;计数资料以百分率表示，采用χ2检验，等级资料采用秩和检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.15组Lewis肺癌荷瘤小鼠肿瘤生长比较与模型组小鼠比较，扶正抗癌方药可以呈剂量依赖性抑制Lewis肺癌荷瘤小鼠肿瘤生长，高、中剂量组与模型组比较，差异有统计学意义（P<0.05），低剂量组与高剂量组、顺铂组比较瘤重增加明显，差异有统计学意义（P<0.05）。根据抑瘤率可以看出，扶正抗癌方高剂量组抑瘤率最接近顺铂组，可以有效发挥抗肿瘤的替代作用。见表1。

2.2扶正抗癌方药对小鼠Lewis肺癌组织Bcl2和Bax mRNA表达的影响模型组Lewis肺癌组织中Bax mRNA表达显著降低，Bcl2mRNA表达显著升高;扶正抗癌方药可以显著升高Lewis肺癌组织中Bax mRNA表达，降低Bcl2mRNA表达，且呈剂量依赖性，与模型组比较，差异有统计学意义（P<0.05），其中中、低剂量组与高剂量组比较，差异有统计学意义（P<0.05），高剂量组与顺铂组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

2.35组小鼠Lewis肺癌组织MMP9表达比较

模型组Lewis肺癌组织中MMP9蛋白表达显著升高，扶正抗癌方药可以显著降低Lewis肺癌组织中MMP9蛋白表达，且呈剂量依赖性，与模型组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。扶正抗癌方藥中、低剂量组与模型组、顺铂组比较，差异有统计学意义（P<0.05），高剂量组与顺铂组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表3。

2.45组小鼠Lewis肺癌组织VEGF、EGFR比较

模型组Lewis肺癌组织中VEGF、EGFR表达显著升高，扶正抗癌方药可以显著降低Lewis肺癌组织中VEGF、EGFR表达，与模型组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。见表4。

3讨论

肺癌归属于中医“癌病”范畴，我们依据中医理论并经多年的临床观察认为正气亏虚、痰瘀毒相互影响是非小细胞肺癌发生发展的主要病机，本虚标实，且有人对中医药治疗晚期非小细胞肺癌进行临床疗效观察显示，在中医辨证分型中气阴两虚证占辨证的多数，且气阴两虚证患者治疗的有效率较高[6]。因而确立了以益气扶正养阴为主，清热化痰、活血化瘀、清热解毒为辅的扶正抗癌方药治疗非小细胞肺癌。

通过实验观察，5组小鼠肿瘤组织均有所生长，扶正抗癌方药高、中剂量组肿瘤均较模型组轻，其中高剂量组最为明显，但较顺铂组抑瘤率略低，由此可见，虽然扶正抗癌方药未及顺铂的抑瘤率，但也能有效抑制肿瘤组织的生长，因而当顺铂等化疗药物出现不良反应及耐药时尝试中医药抗肿瘤不失为一种有效途径。

在肺癌的复发、转移进程中，涉及基因表达的异常、新生血管的形成，信号传导异常等多环节的变化。而中医药抗肿瘤作用机制：1）抑制肿瘤增殖，诱导肿瘤细胞分化和凋亡;2）改善癌基因表达，抑制肿瘤血管生成;3）改善血液流变学指标，活血化瘀;4）提高免疫功能;5）逆转肿瘤细胞多药耐药以利于化疗药物的增效减毒[3]。癌基因激活和抑癌基因失活是肿瘤发生、发展和转移的重要原因，其中Bcl2、Bax均为凋亡相关蛋白，Bcl2通过干扰细胞色素C自线粒体的释放而阻断Caspase蛋白酶的激活而使瘤细胞的凋亡减少，存活时间延长[7]，但其表达与NSCLC临床病理因素无关，并不能作为判定预后的指标[8]。而Bax在非小细胞肺癌中低表达，与Bcl2产生拮抗作用，与之呈现负相关性[9]。肿瘤的转移和转移癌的生长必须要有新生的血管提供血液供应，而促血管内皮生成因子（VEGF）及其受体被认为是作用最强、特异性最高的关键性调控因子。有实验研究表明，VEGF在肺癌中高表达，且与肿瘤的转移及分期有关，可以作为初步判断NSCLC预后的独立指标，较好地评判肿瘤的恶性程度、评估患者的临床分期，反映肿瘤的侵袭和转移[1012]。随着对EGFR基因研究的深入，发现其在大多数NSCLC患者中高表达，在肺癌发生发展中起重要作用，是治疗NSCLC的一个重要靶点[1314]。此外，MMP9水平在NSCLC显著升高，有利于协助预测转移倾向及评价预后[15]。因此，在晚期NSCLC维持治疗中观察Bcl2、Bax、VEGF、EGFR、MMP的表达是有意义的。

本研究显示扶正抗癌方能抑制肺癌细胞增殖，抑制肺癌细胞Bcl2基因的表达，激活Bax的高表达，促进癌细胞凋亡，下调肺癌细胞中VEGF、EGFR、MMP的表达，阻断血管形成，阻断相关信号传导，继而阻断肿瘤细胞的生长、侵袭和转移，且有剂量依赖关系，虽然总体抗肿瘤水平与顺铂相比效果欠佳，但依旧能起到一定条件下的替代作用，为临床中医药维持治疗晚期NSCLC提供了可靠的实验依据。

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（2018-02-09收稿责任编辑：杨觉雄）