氧化石墨烯作为抗肿瘤药物纳米载体的性能研究进展

钟余特 赵立春 唐农 冷静 宋策 王雪 于培良

摘要氧化石墨烯由于其特殊的理化性质现已在各种领域得到了广泛的应用。在肿瘤治疗方面，其常被用作抗肿瘤药物的载体。鉴于其表面丰富的修饰位点，可有目的性地对其表面结构进行改造与修饰以更好地发挥其载药与释药作用。本文综述了部分国内外对其结构改造方面的研究以及将其作为抗肿瘤药物载体的研究，旨在为今后进一步开发其在抗肿瘤方面的应用提供理论依据。

关键词氧化石墨烯;抗肿瘤;结构改造;分散性;血液相容性;细胞粘附性;细胞毒性;纳米载体

中图分类号：R203文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.01.051

石墨烯（Graphene）是一种由碳原子以Sp2杂化方式连接形成的蜂窝状碳结构物质，是目前世界上发现的最薄的新型纳米材料。由于其具有良好的电学、力学、热学、光学及等特性而成为“新材料之王”，被誉为“黑金”[1]。石墨烯性能优异、成本低廉，经过数十年的研究与发展，现已在新能源、复合材料以及生物医学等领域得到了应用[2]。

1分类综述

1.1氧化石墨烯氧化石墨烯（Graphene Oxide，GO）是石墨烯的氧化物，不同原材料及不同方法制备所得的GO结构存在一定差异，故现今对其结构研究尚未很明确，但确定其同石墨烯一样具有六角形蜂巢层状结构，边缘多含有羧基，平面上主要有环氧基、酚羟基、内酯等含氧基团[3]。纯石墨烯不溶于水，而GO由于结构上含氧基团的存在，其片层间具有静电斥力，使其在水及其他有机溶剂中体现良好的分散性，由于GO上面含有如此豐富的修饰位点，可通过对GO中C/O的调节实现对其亲疏水性的调控[45]。鉴于其较高的比表面积与特殊的两亲性，GO可以通过多种作用力与其他分子共价结合，构成的复合纳米材料各种性能都较石墨烯相比更为优异。再加上GO特殊的荧光猝灭以及光热转化特性，其在生物医学领域的应用前景较石墨烯而言更为良好，且已经在药物运输、生物传感、肿瘤光热治疗等方面得到了一定的应用[6]。

现今世界，恶性肿瘤已经严重危害到人类健康，传统肿瘤治疗药物主要有化疗药物和生物制剂，虽然对肿瘤的治疗均有一定效果，但易产生耐药性，而且往往是“杀敌一千，自损八百”地对正常细胞同样具有毒性，因此，研发高效、特异性强、机体耐药性低的抗肿瘤药物显得尤为重要。研究表明，将纳米材料作为抗肿瘤药物的运输载体，通过对纳米材料进行功能化改造，可显著提高纳米载体抗肿瘤药物的靶向性，使抗肿瘤药物在病灶部位或靶部位聚集，降低药物非特异性聚集所致的毒性。此外，利用纳米材料载药，还可以达到对药物进行控释、提高药物的生物膜透过性、提高口服药物的生物利用度等诸多优良作用[7]。而GO作为理化性质优良的新型纳米材料，将其运用于制备靶向抗肿瘤药物具有良好的开发前景。基于此，本文对近些年来开发GO作为抗肿瘤靶向制剂纳米载体的相关研究成果进行综述，旨在为进一步开发高效、低毒的抗肿瘤药物提供理论参考。

1.2改善氧化石墨烯性能的结构改造制备氧化石墨烯作为药物载体，要求其具有较良好的生物相容性，评价药物载体的生物相容性包括血液相容性、细胞毒性、生殖毒性、致畸性等[89]。如需利用氧化石墨烯抗肿瘤药物载体起到靶向抗肿瘤作用，除了需要有良好的生物相容性外，还需要具有良好的细胞粘附性等性能。故通过化学反应改造GO表面的基团，或者将各种有机或无机分子连接其上对其进行功能化修饰，可对其性质有目标地进行优化，从而可以充分实现对GO的功能化应用。

1.3改变GO在溶剂中的分散性能对氧化石墨烯的功能化改造常常在液体环境中进行，GO在水中的分散性较好，而在有机溶剂中的分散能力较弱。为了改善其溶解性，Chao[10]等对氧化石墨烯进行了功能化改造。他们将聚乙二醇与葵二酸进行缩合制得双亲性高分子聚合物。利用甲苯2，3二异氰酸酯（TDI）与GO表面的羧基反应对其表面进行修饰，使TDI充当桥联剂将双亲性高分子聚合物与GO连接在一起，从而对GO进行改性。经过验证，经过改性后的氧化石墨烯在水和DMF中均具有较好的分散效果。

曹也文等[1112]制备了尾端含炔基的氧化石墨烯（ALKtGOS），再用Clicks反应将嵌段共聚物N3SEBS（叠氮修饰的苯乙烯乙烯/丁烯苯乙烯三嵌段共聚物）接枝到ALKtGOS上，制备所得的SEBScGOS在SEBS的良溶剂如DMF、THF、NMP等当中具有良好分散性，而在SEBS的非溶剂中分散性能较差。此外其还将叠氮修饰的单分散聚苯乙烯（N3PS）与尾端含炔基的GOS进行“Click”偶合，制得了PScGOS，其溶剂分散性取决于PS的溶剂分散性，即在PS的良溶剂中分散较好，而在PS的非溶剂中分散较差。

这些实例均体现了功能化GO的分散性能往往取决于GO上接枝的基团性能。通过化学方法将具有特定分散性能的物质连接其上，可以有目的地对GO的分散性能进行调控。

1.4增强GO在生理条件下的分散能力要利用GO进行载药以供机体利用，便需要GO在生理盐水条件下具有良好的分散性能。Di[13]等发现，GO以及GOCOOH在含盐溶液中均会出现聚集现象，而用聚乙二醇（PEG）或大分子量的聚乙烯亚胺（PEI25k）修饰的GO在同样浓度的含盐溶液条件下却表现良好，且在DMEM溶液中的稳定性与NaCl溶液中一致。谢旭东[14]将GO羧基化，然后通过酰胺反应将PEG接枝到GO上，制备GOPEG。实验显示GOPEG在PBS以及细胞培养液中分散性能良好，说明用PEG对GO功能化改善了其生物相容性。PEG在多种极性溶剂中体现较好的溶解性能，其常作为非离子表面活性剂与药物的无免疫控释载体。开发GO的PEG化功能改造，可大大增加GO作为药物载体的价值。

1.5增强GO的血液相容性研究表明，GO的血液相容性与其尺寸大小有关，尺寸为350 nm的GO会产生较严重的溶血，而尺寸为3 μm的GO引起较少的溶血但也会达到10%，微米尺寸的GO不大引起溶血，但易引发凝血现象[1516]。为了降低其溶血能力，除减小其尺寸外或可通过对其进行结构改造达到目的。

徐东[17]等通过对羧基化氧化石墨烯进行血液相容性实验发现，即使当GOCOOH浓度高达100 μg/mL时，其溶血率依然低于5%。何蔼[18]等通过氢键、范德华力、ππ共轭等作用力将壳聚糖、白蛋白与脱氧核糖核苷酸连接在GO上制备成生物高分子氧化石墨烯复合凝胶，通过体外溶血实验发现GOBSA、GOCS、GODNA的溶血率最高均不超过1%。氯乙酸原为剧毒物质，而氯乙酸改性的所计划氧化石墨烯与细胞接触后短期内不体现毒性，且几乎无溶血作用[19]。

对GO的血液相容性改造既可通过直接改造其上官能团，也可将其他小分子或高分子通过共价或非共价键作用连接其上。原本生物相容性很低的物质将其与GO连接后，其功能也会发生较大的改变。

1.6提高氧化石墨烯对细胞粘附性的功能化修饰提高GO作为药物载体的细胞粘附性，可以更大程度上提高药物作用的靶向性。赵长虹[20]等将GO上的羧基活化后，把精氨酸甘氨酸天冬氨酸（ArgGlyAsp，RGD）连接其上，制备得到GORGD膜，相比于GO膜，GORGD上表现出非常好的细胞粘附。徐宏杨等利用L929细胞对GO以及GOPEG进行了细胞粘附性实验，GO对细胞粘附性的随着GO浓度的升高与孵育时间的增长呈现降低的趋势，而PEG功能化的GO对细胞粘附性能的影响明显低于GO。

GO通过对细胞的刺激，抑制了细胞中与粘附性相关的基因表达，从而导致降低细胞的粘附性[21]。对GO进行功能化，降低其对细胞中粘附性相关基因表达的抑制能力，从而提高其血液相容性。

1.7改善氧化石墨烯毒性的功能化修饰未经修饰的GO对于细胞具有一定的毒性，且毒性随着浓度的升高呈现增大的趋势。作为药物载体，GO对于细胞的毒性需控制在安全范围内，若将其用作抗肿瘤治疗方面，则需要其具有选择细胞毒性，即对肿瘤细胞具有选择性杀灭作用。

Robinson等研用聚乙二醇对还原氧化石墨烯（RGO）進行了修饰并利用人上皮乳癌细胞对其进行了细胞毒性实验，发现RGOPEG的细胞毒性远小于未经修饰的RGO[22]。徐志远等利用A549和MCF72种癌细胞对PEG功能化的GO进行细胞毒性实验，结果显示GOPEG对2种细胞的毒性十分小，不具有统计学意义，而将其负载冬凌草甲素后，细胞毒性明显增大，且大于未被负载于GOPEG的游离冬凌草甲素[23]。壳聚糖作为生物相容性良好的生物材料，是很好的抗肿瘤药物载体[24]。曹秀芬[25]等将乳糖酰化壳聚糖（LCO）与GO相连制备得GOLCO+，并利用肝癌细胞（QGY7703）对其进行了细胞毒性研究。发现当GOLCO+的浓度达到500 μg/mL才会出现明显的细胞毒性，而浓度为100 μg/mL时基本不体现毒性。种种实例说明利用生物相容性良好的物质对GO进行结构改造与修饰，可以目标性地控制其细胞毒性并将之加以利用。

1.8功能化氧化石墨烯作为抗肿瘤药物载体

1.8.1作为经典化疗药载体SN38（喜树碱衍生物）由于其水分散性不好而限制了其应用，临床上多用其前药伊立替康（CPT11），而CPT11在转化为SN38之前却代谢了大部分或转变成其他无活性形式。于是戴宏杰[26]等人最早利用功能化GO进行了抗肿瘤药物的载药研究。其利用生物相容性良好的PEG对GO（<50 nm）的支链进行了功能化改造制得NGOPEG，再通过非共价键将SN38负载其上，NGOPEGSN38体现出了极好的水分散性并且保留了SN38在有机溶剂中的高效力。通过实验验证纳米级的NGOPEG不具有细胞毒性，而NGOPEGSN38在体外对人体结肠癌细胞（HCT116）有强效的杀灭作用，细胞毒性是CPT11的23倍。此外，他还用星型PEG对横向尺寸小于10 nm的GO进行了修饰，制备成了超小型NGOPEG，进一步加强了NGOPEG在水以及其他溶剂中的稳定性，而后再将利妥昔单抗（Rituxan）结合在NGOPEG上，最后将制备的复合物负载多柔比星（DOX）。通过比较游离DOX、NGOPEG/DOX、NGOPEGRituxan/DOX在体外环境中对淋巴瘤Raji细胞的作用，发现NGOPEGRituxan/DOX对细胞生长的抑制能力最强，这意味着其在体外环境中具有杀灭癌细胞的潜力。并且NGOPEGRituxan/DOX对DOX的释放在pH为5.8时的大于pH为7.4时，说明其的释药性能与环境的pH密切相关，由于肿瘤细胞周围环境多为偏酸性环境，该药物可作为肿瘤靶向药物[2728]。

徐兴英[29]利用Fe3O4与叶酸（FA）分别对GO进行功能化，制备成Fe3O4GO与FAGO，发现Fe3O4GO具有明显的超顺磁性。在体外环境下浓度为50 μg/mL的Fe3O4GO与FAGO对宫颈癌Hela细胞均不具有细胞毒性。然后将DOX分别负载于其上制得Fe3O4GODOX与FAGODOX，同样用Hela细胞进行体外细胞毒性实验发现Fe3O4GODOX与FAGODOX在体外同样具有明显的抗肿瘤作用。且两中载体对DOX均有缓释作用，其中FAGO具有明显的细胞靶向作用。后来，赵旭波[30]等亦用叶酸对GO进行了修饰，进行DOX负载的相关研究。其将叶酸端基化PEG通过共价键连接在GO微球表面，再通过在球面上交联聚甲基丙烯壳层以防所负载药物发生泄漏，实验发现该复合物能够高效地释放DOX，这是对叶酸修饰GO负载DOX的一次更高层次的改进。

刘国栋[31]等用PEG修饰纳米级GO，再将转铁蛋白（Tf）通过共价键连接其上，再将其负载DOX制得了TfPEGNGODOX。并进行了对TfPEGNGO的载药及释药评价、TfPEGNGODOX的体外以及体内治疗胶质瘤的评价。结果表明，TfPEGNGO对DOX的载药量达到了277 μg/mL，TfPEGNGODOX能在中性条件下保持稳定，在酸性条件下释药速度明显加快，72 h候的释药率达到了30%。对TfPEGNGODOX的溶血实验、细胞毒性实验、胞内摄取定量试验结果显示：1）其在0.1～5.0 μmol/L浓度范围内培养2 h后的溶血率<6%;2）在浓度为800 μg/mL的TfPEGNGO作用下，C6胶质瘤细胞的存活率仍然保持有80%，说明TfPEGNGO作为DOX的载体本身细胞毒性极其微弱，而TfPEGNGODOX对C6胶质瘤细胞的IC50为13 μg/mL;3）通过测量不同时间点（1、2、4、8、12 h）C6细胞内DOX的含量，通过相关计算发现相同DOX浓度下TfPEGNGODOX的细胞摄取速度明显比单纯的DOX以及未用Tf修饰的PEGNGODOX的细胞摄取速度快得多。说明TfPEGNGODOX具有一定的生物安全性，并且对C6胶质瘤细胞具有一定的靶向性杀灭作用。此外，刘国栋等还建立了大鼠C6胶质瘤脑内移植模型对TfPEGNGODOX进行体内抗肿瘤效果实验。通过测量DOX在肿瘤内以及脑组织内的含量发现，TfPEGNGODOX组的脑组织以及肿瘤内的DOX含量明显高于DOX裸药组以及PEGNGODOX组。且通过TfPEGNGODOX观察组的大鼠寿命明显比其他组长，生存期延长率达到了47.1%。这说明TfPEGNGODOX不但在体外有抗C6胶质瘤的作用，在体内同样具有作用，而且具有很好的胶质瘤靶向性。其原因主要是连接于PEGNGO上的Tf，Tf对胶质瘤细胞表面转铁蛋白受体有特异性结合的作用，用其作为靶向功能基可显著提升NGO作为抗肿瘤药物载体的靶向作用。

周锐[32]等利用PEI修饰了GO，利用叶酸（FA）作为PEIGO的靶向功能基，制备了4种金属配位化合物：1）C15H10CuN3;2）C25H18CuN6O14;3）C12H14N6O12Zn;4）C44H36N4P2RuS2，并将这4种金属配合物分别负载于FAPEIGO。并利用2种鼻咽癌细胞NHE1与CNE2对这4种负载金属配合物的载药颗粒进行了细胞毒性实验。发现4种载药颗粒对2种癌细胞均有抑制作用，且对NHE1的抑制作用强过对CNE2的抑制作用。其中载药颗粒2）的作用最强，具有进一步研究与开发的意义。

黎静雯[33]对纳米级GO进行了PEG功能化，再将抗肿瘤药物Pt负载其上制备得PEGNGOPt，发现PEGNGO不仅对Pt具有负载与运输功能，并且可以利用NGO的光热性能协同Pt对宫颈癌Hela细胞进行杀灭，由于光热效应可以增加药物对肿瘤细胞的靶向性，故PEGNGOPt的抗肿瘤性能十分良好。

1.8.2作为中药抗肿瘤化学成分载体冬凌草甲素（Oridonin）为贝壳衫烷类二萜化合物，有研究表明其具有抗肿瘤作用[34]。徐志远[23]等用六臂PEG对GO进行功能化，再将其负载冬凌草甲素展开了系列研究，发现GOPEG对冬凌草甲素的负载率达到了105%。通过利用肺癌细胞（A549）与乳腺癌细胞（MCF7）对GOPEGoridonin进行了细胞毒性实验，未负载冬凌草甲素的GOPEG基本不具有细胞毒性，而GOPEGoridonin对2种肿瘤细胞的杀灭作用比未被负载于GOPEG上的冬凌草甲素更强。毛萼乙素（Eriocalyxin B）為冬凌草甲素的类似物，其对肿瘤细胞同样具有抑制作用[35]。徐志远[36]等同样利用GOPEG负载毛萼乙素并同样研究了其负载率、细胞毒性等性质。结果发现GOPEG对毛萼乙素的负载率为18.8wt%。与GOPEGoridonin一样，GOPEGeriocalyxin B一样对肿瘤细胞产生了杀灭作用，对A549的杀灭作用由强到弱依次为GOPEGoridonin>Oridonin>GOPEGeriocalyxin B>Eriocalyxin B，对MCF7的杀灭作用由强到弱依次为GOPEGeriocalyxin B>GOPEGoridonin>Oridonin>Eriocalyxin B。说明GOPEGoridonin适合开发用于治疗肺癌，GOPEGeriocalyxin B适合开发用于治疗乳腺癌。此外，俞文英[37]等研究了GOPEGoridonin对结肠癌的作用，同样发现其对结肠癌细胞的杀灭作用也比Oridonin裸药强得多。

血根碱（SAN）对人脑胶质瘤细胞具有抑制作用，但其溶解性低、稳定性差，一直很难得到临床应用。崇羽[38]用六臂聚乙二醇对GO进行修饰，再将血根碱负载其上成功地克服了SAN水溶性不好的缺点，并且研究了GOPEGSAN的体外细胞毒性，发现其很好的保持了血根碱的抗肿瘤作用。

1.9作为抗肿瘤基因药物载体Liming[39]等人最早将SiRNA与DOX同时负载于PEI功能化的GO上以实现对药物的贯序传递，并利用宫颈癌Hela细胞进行了细胞毒性实验，实验发GOPEISiRNA/DOX对于肿瘤细胞的杀灭作用大于SiRNA与DOX单独对细胞的杀灭作用，并对用PEIGO作为抗肿瘤药物以及基因药物的载体进行了展望。此后牛高丽[40]等将叶酸（FA）与聚乙二醇（PEG）通过酰胺键连接，再将该复合物与胺甲基芘盐酸盐连接到GO表面对GO进行修饰，再利用该物质与具有负电性靶向的hTERT的SiRNA（抑制凋亡抑制蛋白基因的表达而具有促进细胞凋亡的作用，从而具有抗肿瘤的潜能）连接在一起制成GOPEGFAPyNH2hTERTsiRNA[41]。叶酸对于肿瘤细胞具有高度的靶向性，故通过叶酸修饰GO制备出的复合物对于肿瘤细胞同样具有靶向性[42]。同样通过Hela细胞进行实验发现复合物对癌细胞的杀灭率远大于裸SiRNA。此外其还在GOPEGFAPyNH2hTERTsiRNA上负载了DOX以进行对SiRNA和DOX的贯序传递释药，通过细胞实验发现既负载有SiRNA又负载有DOX的复合物其杀灭肿瘤细胞的能力大于仅负载有SiRNA的药物。

在多种肿瘤细胞中，信号转导子和转录激活子3（Stat 3）均呈现过度表达，会抑制肿瘤细胞的凋亡，阻断该通路的表达可以达到灭杀肿瘤细胞的作用。Zhang[43]等人利用具有Stat 3特异的SiRNA表达质粒，发现其可以成功抑制Stat 3的表达，但并不能完全阻断其表达。殷迪[4445]利用PEG与PEI对GO进行功能化，使GO获得PEG在生理条件下的稳定性以及PEI对基因的靶向作用，制得了GOPEIPEG，再用其对Stat 3特异的SiRNA质粒进行负载。将GOPEIPEGSiRNA Stat 3进行体内实验发现其对小鼠恶性黑色素瘤的生长有抑制作用，且GO具有吸收红外线的能力，通过增射红外光，协同物理作用对小鼠体内的肿瘤进行杀灭。

地西他滨（DAC）是一种腺苷类似物，是目前已知最强的DNA甲基化特异性抑制剂。卢宜梅[46]用一种对肺癌细胞A549具有靶向作用与吸附性的寡糖苷酸链（aptamer A1）对GO进行修饰，然后负载DAC。发现A1GO对DAC的负载率很高，且存在依赖于pH的释药性能，即在偏酸性的条件下释药速率比中性环境中快。此外，其还对A549细胞具有高度靶向性，可吸附于A549细胞并发挥很好的治疗效果。

2讨论

氧化石墨烯由于其特殊的理化性质近年来得到了广泛的应用，尤其是在生物医学方面，其表面丰富的修饰位点使众多的科研工作者们对其载药释药功能十分感兴趣。通过对GO表面进行修饰可以有目的性地改变其理化性质以及生物相容性，使其充分发挥药物载体的作用。GO被修饰后的性质多半取决于其上的功能基团的性质：用血液相容性良好的物质修饰GO，可使GO具有良好的血液相容性;用对病灶具有靶向功能的物质修饰GO，可使GO具有良好的靶向性。其中，氨基酸类物质作为修饰GO的功能基既可使GO具有良好的生物相容性，又可使其具有良好的靶向性，这将是今后对于GO修饰的研究趋势之一。

自2008年首次有科学家对其负载抗肿瘤药方面进行了相关研究以来，现已有对GO负载经典化疗药、抗肿瘤中药成分、基因药物的相关研究。但一直以来研究的主要对象多集中于DOX，而对于其他药物研究很少。某些药物或许本身抗肿瘤活性较低甚至不具备抗肿瘤活性，但将其负载于功能化的GO上或可体现出抗肿瘤活性。若对这一类药物进行负载研究，将会是一个新的探索领域。

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（2018-01-16收稿责任编辑：张文婷）