振动式超微粉碎处理时间对白毛木耳多糖提取率及体外抗氧化性质的影响

邵家威 郝征红 岳凤丽 付建鑫 刘莹 仇荟然

摘 要：利用振动式超微粉碎对白毛木耳进行处理，研究粉碎时间对多糖提取率及多糖抗氧化性的影响。超微粉碎3 min的白毛木耳粉，分别用热水浸提法、索氏提取法、超声微波联用法提取多糖，得率分别为3.8%、4.7%、11.0%。对超微粉碎0～20 min的白毛木耳粉，用超声微波联用法提取多糖，发现超微粉碎20 min时多糖得率最高为48.0%。对不同超微粉碎时间制备的多糖进行抗氧化性质的研究，结果发现，超微粉碎20 min后提取的多糖对OH-自由基的清除率最高，达到29.4%;超微粉碎8 min后提取的多糖对DPPH自由基的清除率最高，达到79.7%;超微粉碎15 min后提取的多糖对O2-自由基的清除率最高，达到92.5%。振动式超微粉碎时间与白毛木耳多糖提取率呈正相关关系，对OH-自由基、DPPH自由基、O2-自由基的抗氧化性无正相关关系。

关键词：振动超微粉碎;粉碎时间;白毛木耳;多糖;抗氧化

毛木耳属于担子菌纲木耳目木耳科木耳属中的毛木耳种[1-2]。与黑木耳相比，毛木耳耳片大、厚、质地粗韧，且粗纤维[2]、蛋白质[3-5]、矿物质、维生素[6]、多糖[7-9]的含量较高。超微粉碎是指利用机械或流体动力的方法克服固体内部凝聚力使之破碎，从而使产品具有界面活性，呈现出特殊功能的过程[10]。本文使用的振动式药物粉碎机应用于毛木耳精深加工领域，可以提高毛木耳口感，有利于营养物质吸收，提高资源利用率。目前，对于不同超微粉碎时间影响白毛木耳多糖得率以及体外抗氧化性质均未见研究。本文研究了不同超微粉碎时间对多糖提取得率的影响，并测定了白毛木耳多糖的体外抗氧化的能力，以期为毛木耳的深加工研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

白毛木耳，山东济宁市鱼台毛木耳种植基地;无水乙醇、H2SO4、HCl、CHCl3、正丁醇、NaOH、H2O2，分析纯，天津市天力化学试剂有限公司;无水葡萄糖、苯酚、Na2HPO4、NaH2PO4、FeSO4·7H2O、邻菲罗啉、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、邻苯三酚、Tris-Hcl，天津市恒兴化学试剂制造有限公司。

1.2 仪器与设备

振动式药物超微粉碎机（WZJ-6J），济南倍力粉技术工程有限公司;超声波微波组合反应系统（XO-SM200），南京先欧仪器制造有限公司;紫外可见分光光度计：UV-5500PC，上海元析仪器有限公司;电子分析天平：AL-104，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司;电热鼓风干燥箱：GZX-9240MBE，上海博涵实业有限公司设备厂;冷冻高速台式离心机：TGL-16M，湘仪离心机仪器有限公司;旋转蒸发器：RE52CS-2，上海亚荣生化仪器厂。

1.3 试验方法

1.3.1 原料预处理 将白毛木耳切分小块于50 ℃下烘干至恒重。超微粉碎3、8、10、15、20 min得到不同时间品级的原料干粉，依次经过无水乙醇、乙醚浸提除去醇溶性色素、游离脂肪，反复多次，烘干备用。

1.3.2 绘制葡萄糖标准曲线 参考萨仁高娃等[11]的方法，采用硫酸—苯酚法测定多糖含量。精确吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL C6H12O6标准溶液（1mg/mL）于试管中，分别加蒸馏水至1 mL，依次加入1 mL 6%苯酚溶液、5 mL浓H2SO4后摇匀静置2 min，沸水反应15 min取出，冷却至室温并于490 nm处测定吸光值。

1.3.3 不同提取处理方式对白毛木耳多糖提取率的比较 选取经过1.3.1处理后的白毛木耳粉，比较3种提取方法的多糖提取效果，筛选最佳提取方法：（1）热水浸提法：将3 g超微粉碎3 min的白毛木耳粉，在料液比为1∶ 60、提取温度90±5℃、浸提时间6 h、提取剂：H2O的条件下提取后，测定多糖含量。（2）索氏提取法：将3 g超微粉碎3 min的白毛木耳粉，在料液比为1∶ 60、提取温度95±5 ℃、回流时间6 h、提取剂：H2O的条件下提取后，测定多糖含量。（3）超声微波联用法[12]：将3 g超微粉碎3 min的白毛木耳粉，分别在料液比为1∶ 60、提取温度70 ℃、超声功率720 W、超声时间22 min、微波功率600 W、微波時间90s的条件下提取后，测定多糖含量。

1.3.4 Sevege法[13]除蛋白 配制4∶ 1的氯仿/正丁醇溶液，加入4倍白毛木耳多糖粗提液剧烈振荡混合后，静置30 min，重复多次至中间层无蛋白。取脱蛋白后的粗提液离心（4 ℃、10 000 r/min、10 min）后，上清液即为粗多糖溶液。

1.3.5 多糖醇沉 取200 mL的粗多糖溶液，加入4倍无水乙醇，4℃醇沉12 h。在11 000 r/min、4℃条件下离心15 min，多组分制备取沉淀，将沉淀复溶后置于冷冻干燥机，干燥完成后的粉末即为白毛木耳粗多糖。

1.3.6 提取成分鉴定[14] （1）茚三酮反应：取1 mL粗多糖溶液，加入2滴0.2%茚三酮，摇匀后沸水浴3 min，冷却。（2）双缩脲反应：取1 mL粗多糖溶液，加入3滴10% NaOH，边摇匀边加入4滴0.5% H2SO4;（3）DNS显色反应：取1 mL粗多糖溶液，加DNS试剂2 mL，沸水浴2 min，冷却后在520nm波长下测定吸光度。（4）硫酸苯酚显色反应：取1 mL粗多糖溶液，加入1 mL 6%苯酚溶液、5 mL浓硫酸，沸水浴15 min，冷却后在490 nm波长下测定吸光度。

1.3.7 多糖得率计算

式（1）中，N—多糖得率（%）;C—从标准曲线中求得多糖含量（mg）;A—原料干重（mg）;B—定容体积（mL）;K—稀释倍数;T—样品体积（mL）。

1.3.8 不同超微粉碎时间多糖的提取 将超微粉碎3、8、10、15、20 min的白毛木耳粉分别按照1.3.3中确定的方法进行多糖提取，4 ℃保存备用。

1.3.9 白毛木耳多糖体外抗氧化研究

（1）OH-自由基清除能力测定：利用Fenton法[13]反应原理，测定多糖对清除羟基自由基的能力。配置浓度梯度为10、8、4、2、1、0.5、0.25 mg/mL的白毛木耳多糖溶液。按照表1试剂依次加入，摇匀并置于37 ℃水浴中反应1 h，冷却至室温，于510 nm处测定吸光值。

式（2）中，B—OH-自由基清除率;A0—空白組吸光值;A1—对照组吸光值;A2—样品组吸光值。

（2）O2-自由基清除能力测定：采用邻苯三酚自氧化法[13]测定白毛木耳中多糖对超氧自由基的清除能力。配置浓度梯度为4、1、0.5、0.25、0.125 mg/mL的白毛木耳多糖溶液。按照表2依次加入，摇匀置于25 ℃水浴中反应4 min，取出后加入5滴10 mol/L的盐酸，充分振荡终止反应，迅速于波长325 nm处测定吸光值。

式（3）中，F—O2-自由基清除率;A0—空白组吸光值;A样—样品吸光值。

（3）DPPH自由基清除能力测定：精确称取4 mg DPPH，无水乙醇溶解定容至100 mL容量瓶中。配置浓度梯度为10、8、4、2、1、0.5、0.25 mg/mL的白毛木耳多糖溶液，按表3依次加入，充分混匀，避光反应30 min，于波长517 nm处测定吸光值。

式（4）中，M—DPPH自由基清除率、AP—空白组吸光值、AD—对照组吸光值、AQ—样品组吸光值。

2 结果与讨论

2.1 绘制葡萄糖标准曲线

以吸光值（A）为纵坐标、葡萄糖含量（mg）为横坐标作回归分析，得回归方程：y=10.373x-0.015 5，R2=0.999 2（图1）。

2.2 提取成分鉴定结果

由表4可知，白毛木耳多糖溶液中含有还原糖、多糖，不含有氨基酸、蛋白质，故可测定其抗氧化性能。

2.3 不同提取处理方式对白毛木耳多糖提取率的影响  由图2可知，用热水浸提法和索氏提取法提取超微粉碎处理3 min的白毛木耳粉，多糖得率分别是3.8%、4.7%;使用超声微波联合提取法提取白毛木耳中的多糖时，得率大幅度增加，为11.0%，较前两者分别增加了7.2%、6.3%。热水浸提法和索氏提取法仅是通过提取剂将毛木耳粉的胞外多糖进行提取，而超声微波联用可通过超声辅助对细胞壁进行破碎，使胞内多糖溶出。因此，超声微波联合提取白毛木耳多糖高效节能，本文选择该方法提取白毛木耳多糖。

2.4 不同超微粉碎时间对白毛木耳粉多糖提取率的影响  由图3可知，随着粉碎时间的增加，多糖提取得率明显增大。超微粉碎3 min和20min的白毛木耳粉中多糖得率分别为11.0%、48.0%，多糖得率增加了38.0%;10～20min时，多糖得率上升幅度逐渐变缓。造成这种原因是随着超微粉碎时间的延长，物料粒度减小，细胞壁破碎，多糖快速溶出，多糖得率大幅度提高。

2.5 不同超微粉碎时间对白毛木耳多糖抗氧化性质的影响2.5.1 白毛木耳多糖对OH-自由基清除作用 由图4可知，不同超微粉碎时间的白毛木耳粉中多糖溶液，在多糖溶液相同浓度下随着超微粉碎时间的增加，对羟基自由基的清除能力是依次上升的;同一超微粉碎时间的白毛木耳粉，当多糖溶液的浓度增加时，对羟基自由基的清除能力也是依次上升的。提取超微粉碎8、10、15、20 min时的白毛木耳粉中的多糖溶液，在浓度为0.25 mg/mL时，OH-自由基清除率分别为6.5%、7.9%、9.9%、11.9%，相比超微粉碎3 min时多糖溶液的清除率分别增加了0.4%、1.8%、3.8%、5.8%，即超微粉碎时间20 min时多糖对OH-自由基的清除率是最佳的。超微粉碎20 min时原料中提取的多糖对OH-自由基的清除率，在浓度10 mg/mL时比8 mg/mL迅速增加了12.5%，较超微粉碎15 min时提取的多糖溶液（10 mg/mL）清除率增加了11.6%，因此超微粉碎时间20 min时提取的多糖，清除率最佳。白毛木耳多糖对OH-自由基的清除能力不强，这与前人对铁皮石斛多糖[15]的研究相似。

2.5.2 白毛木耳多糖对DPPH自由基清除作用 由图5可知，相同超微粉碎时间的原料多糖提取液浓度增高时，对DPPH自由基的清除能力依次上升;不同超微粉碎时间的原料多糖提取液，在相同浓度下随着超微粉碎时间的增加，对DPPH自由基的清除能力先上升后降低。超微粉碎3、10、15、20 min时的白毛木耳多糖溶液，在浓度为10.0 mg/mL时，DPPH自由基清除率分别为70.0%、73.8%、39.2%、36.4%，较超微粉碎时间为8min时的清除率分别减小了9.7%、5.9%、40.5%、43.3%;超微粉碎时间为8min时，相比10 mg/mL增幅为18.1%，较超微粉碎3 min时提取的多糖溶液（10 mg/mL）清除率增加了9.7%。综上，超微粉碎时间8 min时提取的多糖，清除率最佳。造成此现象原因是超微粉碎时间越长，多糖的分子量随之减小，抗氧化能力减弱[16]。

2.5.3 白毛木耳多糖对O2-自由基清除的作用测定 由图6可知，相同超微粉碎时间的原料多糖提取液浓度增高时，对O2-的清除能力依次上升;不同超微粉碎时间的原料多糖提取液，在相同浓度下随着超微粉碎时间的增加，对O2-的清除能力先上升后降低。提取超微粉碎3、8、10、20 min时的白毛木耳粉中的多糖溶液，4.0 mg/mL时O2-自由基清除率分别为35.1%、42.7%、55.2%、52.3%，相比超微粉碎时间为15 min时的白毛木耳粉中多糖的清除率分别减小了57.4%、49.8%、37.3%、40.2%，即超微粉碎时间15 min时多糖对O2-自由基的清除率是最佳的。超微粉碎15min时原料中提取的多糖对O2-自由基的清除率，在浓度4.0 mg/mL时比1.0 mg/mL迅速增加了8.9%，较超微粉碎10 min时提取的多糖溶液（4.0 mg/mL）清除率增加了37.3%，因此超微粉碎时间15 min时提取的多糖，O2-清除率最佳。这与马亚丽[16]对油菜花多糖的研究相同，多糖的生物活性能力的不同与多糖分子量的大小密切相关。

3 结论

在超声空化效应和微波的联合作用下，白毛木耳多糖的提取率较索氏提取法、热水浸提法有大幅提高。超微粉碎20min时的白毛木耳多糖对OH-自由基的清除率达到最高29.4%;超微粉碎8min时物料中的多糖对DPPH自由基的精除率最强达到79.7%;超微粉碎15min时物料中的多糖对超氧阴离子自由基的清除能力最强达到92.5%。经过振动式药物超微粉碎机处理白毛木耳，粉碎时间与多糖得率呈正相關，从10～15min多糖得率增幅为19%。因此，不同超微粉碎时间白毛木耳粉中多糖的抗氧化能力呈现一定的量效关系且原料粒度对多糖得率影响较大。

参考文献

[1]陈诚，黄文丽，李小林，等.毛木耳多糖提取研究进展[J].食品与发酵技，2014，50（4）：89-92.

[2]刘波.中国真菌志第23卷[C].北京：科学出版社，2005：10.

[3]张莉，于国萍，齐微微，等.碱溶酸沉法提取黑木耳蛋白质的工艺优化[J].食品工业，2015，36（6）：24-27.

[4]袁保红，杜青平.地木耳蛋白质提取工艺及其稳定性的研究[J].食品研究与开发，2007（4）：117-120.

[5]赵玉红，林洋，张智，等.碱溶酸沉法提取黑木耳蛋白质研究[J].食品研究与开发，2016，37（16）：32-36.

[6]杨春瑜，方迪，齐勇.黑木耳超微粉氨基酸和维生素含量变化及原因[J].中国食用菌，2004（6）：33-35.

[7]曹蕊，清源.毛木耳水溶性多糖的提取工艺[J].食品研究与发，2010，31（12）：81-92.

[8]Fengming Ma，Jingwei Wu，Pu Li，et al.Effect of solution plasma process with hydrogen peroxide on the degradation of water-soluble polysaccharide from Auricularia auricula.II：Solution conformation and antioxidant activities in vitro[J].Carbohydrate Polymers，2018（198）：575-580.

[9]Jingwei Wu，Pu Li，Haitian Zhao，et al.Effect of solution plasma process with hydrogen peroxide on the degradation and antioxidant activity of polysaccharide from Auricularia auricula[J].International Journal of Biological Macromolecules，2018（117）：1299-1304.

[10]张美霞，任晓霞.超微粉碎过程对金银花中功能成分的影响[J].食品科学，2016，37（8）：51-56.

[11]萨仁高娃，姜波，胡文忠，等.辣椒及辣椒食品中可溶性多糖抗氧化活性研究[J].食品工业科技，2012，33（11）：127-129、133.

[12]陈庆敏，于辉，姜桂传，等.超声波-微波协同提取毛木耳粉中多糖的工艺优化[J].食品科技，2014，39（11）：192-197.

[13]段雅庆.芦笋中黄酮和多糖的复合提取及其抗氧化活性研究[D].武汉：华中农业大学，2010.

[14]郝海燕，沙爱龙.硬枝碱蓬化学成分的定性分析及生物碱含量的测定[J].食品科技，2013，38（1）：244-247.

[15]王建明，古力，康智明，等.铁皮石斛多糖的提取工艺优化及其抗氧化活性研究[J].西北农林科技大学学报（自然科学版），2013，41（12）：143-148.

[16]马亚丽.油菜花粉超微粉多糖分子量分级及生物活性研究[D].福建：福建农林大学，2009.

Abstract：Auricularia polytricha was crushed by vibratory type superfine pulverizer in this experiment and the effects of grinding time on the extraction rate of polysaccharides and the antioxidation of polysaccharides were studied.The polysaccharide was extracted by hot water leaching，sol extraction and ultrasonic microwave，and the yield was 3.8%，4.7% and 11.0%，respectively，with super-slightly crushed 3 min white fungus powder.The agaric powder was finely crushed for 0 to 20 minutes then extracted by ultrasonic microwave method，we found that the highest rate of polysaccharide was 48.0% at 20 minutes.The antioxidant properties of polysaccharides prepared at different times of superfine grinding were studied.Polysaccharides obtained after 20 minutes of ultrafine crushing had the highest removal rate of hydroxyl free radical，reaching 29.4%.The highest removal rate of DPPH free radicals was the polysaccharides obtained after 8 minutes of ultrafine crushing，reaching 79.7%.The highest removal rate of superoxide anion radical was the polysaccharides obtained after 15 minutes of ultrafine crushing，reaching 92.5%.There was a positive correlation between the time of vibrating superfine grinding and the extraction rate of polysaccharides of Auricularia polytricha，however，there was no positive correlation between hydroxyl free radical，DPPH free radical and superoxide anion radical.

Keywords：vibration ultrafine pulverization;crushing time;Auricularia polytricha;polysaccharide;antioxidant

（责任编辑 唐建敏）