外泌体分离技术及其临床应用研究进展

高方园, 焦丰龙, 张养军, 秦伟捷, 钱小红

(军事科学院军事医学研究院生命组学研究所, 蛋白质组学国家重点实验室,北京蛋白质组研究中心, 国家蛋白质科学中心-北京, 北京 102206)

外泌体(exosomes)是一类由细胞分泌到胞外的囊泡,最早由Pan[1]和Johnstone[2]在绵羊网织红细胞中发现并命名。随着研究的深入,人们[3]发现包括血细胞、免疫细胞、癌细胞、干细胞等在内的几乎所有细胞都可以产生外泌体,所产生的外泌体不仅存在于细胞培养液中,也存在于血液、尿液、母乳、唾液、胸腔积液等体液中。与其他两种胞外囊泡(微囊泡和凋亡小体)相比,外泌体在产生方式、尺寸、密度和内容物等方面存在明显差异。不同于微囊泡“出芽”的形成方式,外泌体主要通过胞吐过程释放至细胞外:首先细胞膜向内凹陷形成早期核内体(early endosomes),早期核内体进一步内陷形成多泡体(multivesicular bodies, MVBs),其中一部分多泡体与溶酶体(lysosome)融合,进而降解;另一部分与细胞膜融合,将其内部所包含的囊泡释放至胞外,即为外泌体[4]。

外泌体具有独特的物理化学性质,其直径为30～200 nm,密度为1.13～1.19 g/mL,组成包括细胞来源相关的脂质、蛋白质、RNA、DNA等物质,在其表面连接有大量的糖链,如甘露糖、聚乳糖胺和α-2,6-唾液酸等[5]。外泌体中常见的磷脂包括鞘磷脂、胆固醇、磷脂酰胆碱、神经酰胺、磷脂酰胆碱等。但是由于特殊的产生方式,外泌体所含的脂质可能与来源细胞膜存在显著差异。例如,与PC-3细胞相比,PC-3细胞外泌体中含有较高丰度的鞘糖脂、鞘磷脂、胆固醇和磷脂酰丝氨酸[6]。外泌体常见的表面蛋白质包括四跨膜蛋白(如CD63、CD9、CD81)、黏附蛋白(如L1CAM、LAMP2)、整合素和糖蛋白(如纤连蛋白)等[7,8],而外泌体囊泡内蛋白质则与来源细胞内的蛋白质密切相关,包含例如热休克蛋白(HSP70、HSP90)和细胞骨架蛋白(actin、tubulin、cofilin)等[9]。除此之外,外泌体中还携带有来源细胞的miRNAs、mRNAs、non-coding RNAs、circular RNAs和DNA等遗传物质。外泌体的完整囊泡结构能够保护其内部生物分子不受体液中各种酶的影响从而保持其完整性和生物活性。例如,外泌体中包含的mRNAs和miRNAs在进入受体细胞后仍具有翻译蛋白质、促进病毒感染等功能[10]。据估计,单个外泌体含有约≤100拷贝数的蛋白质和≤10 000拷贝数的核苷酸[11]。不同细胞来源的外泌体中既包含与细胞形成、结构和物质转运相关的共有成分,也包含与来源细胞的生物功能相关的特异分子。如B淋巴细胞、树突状细胞、肥大细胞和肠上皮细胞来源的外泌体含有大量的主要组织相容性复合体蛋白质MHC class Ⅱ和MHC class Ⅰ,血小板和T细胞来源的外泌体则包含诸如血管性血友病因子、穿孔素和颗粒酶等特殊蛋白质[12],而癌细胞来源的外泌体表面可能含有肿瘤特异的蛋白质分子[13]。这类特异分子在外泌体介导细胞信号转导、参与生理病理过程中发挥至关重要的作用。

1 外泌体的研究策略

外泌体包含大量跨膜蛋白质和胞内蛋白质,虽然不同细胞来源的外泌体的大部分蛋白质组成相近,但是也有少量蛋白质具有细胞特异性,能够反映分泌细胞的类型和病理生理条件。因此通过对外泌体进行蛋白质组学分析,可以获得有关来源细胞生理状态的重要信息[14]。基于蛋白质组学的外泌体研究可概括为如下流程(见图1)[15]: (1)外泌体提取及表征;(2)基于高分辨质谱的外泌体蛋白质组鉴定;(3)利用生物信息学对外泌体蛋白质组进行系统生物学分析。对于外泌体而言,寻找最佳的分离与表征方法是目前急需解决的关键问题。

2 外泌体的提取方法

如何高效、高纯度地富集外泌体是实现其组学分析和功能研究的关键。然而外泌体体积小,密度低,加之在粒径与组成方面存在异质性,即使同种细胞产生的外泌体也有可能形态各异[16],给外泌体的提取带来巨大困难。而不同的细胞来源的外泌体不仅大小和标志蛋白质表达量存在差异[17,18],其密度也有所不同。例如B细胞的外泌体密度约为1.13 g/mL[19],上皮细胞外泌体密度约为1.19 g/mL[20]。另外,实际样本中不仅存在大量高丰度杂质蛋白质的干扰,还有与外泌体具有相似生物物理学参数(表面化学组成和结构、尺寸、表面电荷、吸光度等)的其他类型囊泡,或某些疾病相关的免疫复合物和蛋白质复合物。以上因素均可能严重影响外泌体的有效提取,给后续的组学分析和功能研究造成不可忽视的影响。

如今已发展了多种基于外泌体尺寸、密度及免疫表型的提取方法,包括超速离心法、密度梯度离心法、聚合物沉淀法、超滤法、体积排阻色谱、免疫亲和法等。

图 1 基于高通量质谱的外泌体蛋白质组学研究策略[15]Fig. 1 Overview of the methodological approaches in high-throughput mass spectrometry-based proteomic analyses of exosomes[15]

图 2 常用的外泌体分离方法Fig. 2 Working principle of commonly used methods to isolate exosomes

2.1 超速离心法

超速离心法根据外泌体的密度及尺寸进行分离。该方法包括一系列离心过程:首先在300、2 000和10 000 g离心力作用下去除样本中的细胞、细胞碎片和大囊泡,随后在110 000 g条件下收集外泌体,最后用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗沉淀以去除可溶的干扰蛋白质(见图2a)。在该方法中,外泌体的提取效率受离心力、样本黏度、PBS清洗次数等因素的影响,高黏度样本[21]、多次清洗[22]可能导致较低的外泌体回收率。超速离心法是目前外泌体分离的“金标准”,是目前使用最为广泛的方法,其优势包括方法成熟、适用于大体积样本。然而,该方法的缺点在于需要依赖昂贵的仪器,操作耗时费力,所得的外泌体易受蛋白质聚合体和脂蛋白的干扰。

密度梯度离心法属于一种更为严格的超速离心法,能够根据样品密度进一步纯化囊泡,克服蛋白质共沉淀造成的污染。常用的分离介质包括碘克沙醇[23]和蔗糖[24]。以蔗糖为例,实际操作时,需要预先制备不同浓度梯度的蔗糖/D2O溶液,随后加入待分离物质;在超速离心力的作用下,外泌体将在等密度区域(1.13～1.19 g/mL)驻留,收集该组分即可得纯化的外泌体(见图2b)。密度梯度离心法相较于传统差速离心法提得的外泌体更纯,但是操作更为繁琐,离心耗时也更长。

2.2 体积排阻色谱

体积排阻色谱法以不同粒径的聚合物凝胶填料作为分离介质,基于尺寸特征实现外泌体的分离。操作时,将样本加入纯化柱后用PBS洗脱,小分子可进入凝胶孔内而大分子直接流出,因此小分子驻留时间更长(见图2c)。通过收集适当时间的组分,即可得到纯化的外泌体。目前已有多种商品化的外泌体纯化柱,包括GE Healthcare的EVSecond纯化柱和Izon的qEV系列试剂盒等。该方法的优势在于无需使用离心机,样品以自然滴落的方式收集;所得的样本纯度高,可有效去除杂蛋白质的干扰;方法重现性好[25]。但是纯化柱对样本的体积有严格限制,不适用于处理体积较大的样品,而且洗脱液会稀释样本,导致最终产物浓度低[26]。

2.3 超滤法

超滤法是另一种常用的根据尺寸差异实现外泌体分离的方法,其原理与传统的膜分离法相同。该方法通常选用相对分子截留量为100 kDa的超滤管,能够在提取外泌体的同时浓缩样本量,尤其适用于细胞培养液、尿液等大体积样本[27](见图2d)。相比于超速离心法,超滤法在低转速下即可实现外泌体的分离,耗时短且不影响外泌体的生物活性。但是滤膜吸附的囊泡和蛋白质,不仅严重影响外泌体的提取效率,还可能堵塞滤孔,降低滤膜的寿命[28]。

2.4 亲和法

亲和提取法是目前特异性最好的一种外泌体提取方法,也是唯一一种能够识别特定细胞来源的外泌体的方法。外泌体的亲和提取主要通过抗体与外泌体膜蛋白质之间的特异性相互作用实现(见图2e)。所使用的抗体为单抗或多抗,目标蛋白质可以是外泌体表面普遍具有的CD63、CD9、CD81等跨膜蛋白质、膜联蛋白质和上皮细胞黏附分子(EpCAM)等[29,30],也可以是癌细胞外泌体表面独有的标志性蛋白质。例如,表面修饰A33(结肠上皮细胞特异性蛋白质)抗体的免疫磁珠能用于结肠癌细胞系LIM1215培养液中的结肠癌细胞外泌体的提取[31];单抗药物赫赛汀(该类药物属于人源抗原癌基因人类表皮生长因子受体2 (HER2)单克隆抗体药物,适用于HER2过度表达的转移性乳腺癌)修饰的免疫磁珠不仅能够提取HER2过度表达的乳腺癌细胞系培养液中的癌细胞外泌体,而且能够捕获恶性腹水中含有HER2的外泌体[32];利用anti-CD9抗体和抗前列腺特异性膜蛋白抗原(anti-PSMA)修饰的免疫磁珠,可以实现前列腺癌细胞培养液和前列腺癌患者血浆中前列腺癌细胞外泌体的特异性提取[33]。此外,也可以通过凝集素与外泌体表面糖蛋白之间的亲和作用力实现外泌体的富集。这种方法常用于尿液,选择性稍逊[34]。Nakai等[35]利用蛋白质T淋巴细胞膜蛋白4 (Tim4)与外泌体表面磷脂酰丝氨酸之间的特异性亲和作用力,建立了一种外泌体纯化方法。由于Tim4和磷脂酰丝氨酸之间的结合依赖于Ca2+,因此通过添加钙离子螯合剂EDTA即可释放捕获的囊泡,得到完整结构的外泌体。然而,由于抗原抗体结合需要足够的作用时间,亲合法普遍存在操作耗时,提取效率低的缺点,不适用于大规模的分析。另外,外泌体生物活性易受洗脱液中极端pH和盐浓度影响,不利于下游实验[28]。

2.5 基于聚合物的共沉淀法

聚合物沉淀法是商业化外泌体提取试剂盒通常采用的策略,其中聚乙二醇是目前最常用的沉淀试剂。一般认为聚合物沉淀法的原理是聚合物通过“劫持”水分子,降低外泌体溶解度,进而在低速离心条件下发生沉降[5](见图2f)。该方法通过常规离心即可实现分离,操作简单,囊泡回收率高[36],然而提取的产物包含大量的脂蛋白和RNA复合物,纯度极差,而且其中的聚合物难以去除,对下游分析产生不良影响[37]。

2.6 外泌体提取新方法

鉴于现有方法存在提取时间长、提取效率低、特异性不佳等不足,难以满足科研需求,近年来科研工作者们发展了多种新型外泌体提取方法,以实现外泌体快速高效的富集。

图 3 基于TiO2的外泌体富集原理示意图Fig. 3 Mechanism of TiO2-based exosome isolation

其中一个重要的分支是以微流控为基础实现外泌体的分离。基于微流控技术的外泌体分离检测可概括为几个主要类别,包括基于尺寸、表面带电、免疫亲和或流体技术等实现外泌体分离,具有所需样本小、分离速率快、纯度高等优点。基于尺寸的外泌体分离装置包括纳米孔[38]、纳米通道[39]、纳米过滤器[40]和纳米孔膜[41]等,使用此类装置能够有效避免杂蛋白质和其他种类胞外囊泡的干扰,得到粒径较为均一的外泌体。根据外泌体表面带负电这一特性,研究人员设计了多种能够通过静电作用力捕获外泌体的微流控装置。Yasui等[42]将ZnO金属丝固定于微流控基座,利用金属丝表面正电性质富集外泌体,而当在金属丝表面涂覆中性Al2O3后,该装置捕获外泌体的能力受到严重影响。Heller等[43,44]设计了一种交流电微芯片装置,能够利用静电作用力从血液中快速分离外泌体,随后利用免疫荧光技术原位检测所捕获的外泌体,对疾病的早期诊断有极大帮助。基于免疫亲和的微流控芯片技术具有极高的特异性,能够从血样中得到高纯度的外泌体[45]。通过在芯片表面固载肿瘤外泌体特异性蛋白质的抗体(表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(EGFRvⅢ)、表皮生长因子受体(EGFR)、血小板源性生长因子受体(hPDGFR)、平足蛋白(Podoplanin)、内皮细胞受体蛋白酪氨酸激酶A2(EphA2)和西妥昔单抗(Cetuximab)),甚至能够从血液中捕获并分析肿瘤特异性外泌体[46]。利用流体技术同样能够实现外泌体的高效分离。例如Liu等[47]通过在介质中添加少量生物兼容性聚合物控制作用于外泌体上的黏弹力,由此实现外泌体的分离。Wu等[48]建立了一种基于声学流体(即声学和微流体的整合)的分离方法,能够以无标记和无接触的方式从全血中直接分离外泌体,血细胞去除率超过99.999%。基于微流控的外泌体分离技术在疾病诊断领域表现出极大的优势。

此外,利用外泌体膜的相关性质也能实现外泌体的提取分离。例如利用外泌体膜表面带负电这一特征,Heller课题组[43,44]借助静电作用力将外泌体捕获在带正电的电极周围。Wu等[49]建立了一种名称为细胞外囊泡全面恢复和净化(extracellular vesicles total recovery and purification, EVTRAP)的胞外囊泡富集方法,利用磁球表面的亲水基团和亲脂基团与外泌体膜表面脂质分子之间独特的亲和力实现外泌体的富集。Wan等[50]建立了一种基于脂质纳米探针的外泌体富集方法,探针一端为脂质,能够插入外泌体表面的磷脂双分子层,另一端为生物素,能够与磁球表面的链霉亲和素特异性结合,从而实现血浆中外泌体的快速、高效提取。本实验室从外泌体表面磷脂分子的结构出发,建立了一种全新的、基于TiO2和磷脂分子的磷酸基团之间特异性相互作用的外泌体提取方法(原理见图3)[51]。该方法将外泌体的提取时间由传统超离法的7～10 h缩短至5 min,同时模型外泌体的回收率可达93.4%,远远高于其他传统方法。理论研究表明TiO2与外泌体之间存在有化学键参与的特异性相互作用,因此TiO2微球能够实现混合样品和复杂实际样本(血清)中外泌体的特异性富集。通过对胰腺癌患者血清外泌体与健康人血清外泌体的蛋白质组研究,发现65种异常表达的蛋白质(P<0.01, Log FC>2; FC: fold change),其中59种在胰腺癌患者中表达上调,与包括胰腺癌在内的多种癌症密切相关,证明该方法在基于外泌体的肿瘤标志物研究中具有重要应用价值。

3 外泌体的表征手段

为获得外泌体的大小、浓度、形态及蛋白质组成等信息,可以通过电镜、动态光散射、纳米颗粒跟踪分析仪、蛋白质免疫印迹、酶联免疫吸附法、流式细胞仪等对外泌体进行表征。

通过电镜可获得外泌体的形态信息,不同类型的显微镜由于操作环境不同,得到的外泌体形态存在差异。例如,在扫描电镜、透射电镜和原子力显微镜中,外泌体呈现囊泡独有的茶托形[5],可能由于样品在固定或染色过程中极度脱水,导致外泌体塌陷所致。与之相反,在冷冻电镜中外泌体呈现圆形,由于不会脱水变性,所得的外泌体形态可能更加接近囊泡的真实状态[52]。另外,由于透射电镜和原子力显微镜具有较高分辨率,也能够提供外泌体磷脂双分子层厚度、粒径分布等信息[53]。Knepper等[53]通过对透射电镜得到的200个囊泡进行粒径分析,结果表明尿液中外泌体的粒径分布约为35～40 nm,磷脂双分子层厚度约为直径的1/5～1/10。透射电镜结合免疫金标记法能够得到外泌体表面特征分子的信息[54],有助于揭示外泌体的产生机制与来源。

动态光散射(dynamic light scattering, DLS)和纳米颗粒跟踪分析(nanoparticle tracking analysis, NTA)都是利用光学手段获得囊泡粒径分布的方法。两者的不同之处在于动态光散射通过检测散射光的强度计算得到颗粒粒径,而纳米颗粒跟踪分析通过追踪单个粒子的运动轨迹计算得到样品浓度、粒径分布等信息[5]。目前两种方法都被广泛应用于外泌体颗粒数目和粒径分布的测量,但两种方法也各有不足。动态光散射法中散射光强度依赖于颗粒质量(体积),混合体系中大囊泡的存在(即使只有很少的量)将严重影响测量结果,因此动态光散射法更适用于单分散体系。而且动态光散射法所得的结果强烈依赖于所应用的数学算法。而采用纳米颗粒跟踪分析仪对不同粒径范围的囊泡进行检测时,为了得到准确的浓度和粒径信息,需要根据所要测量的颗粒粒径范围对仪器分别校准,操作繁琐。受检测灵敏度所限,纳米颗粒跟踪分析仪适用于粒径范围50 nm～1 μm的颗粒,粒径小于50 nm的外泌体无法检测[55]。除此之外,两种方法都依赖光散射和粒子的布朗运动进行分析,难以区分合成的纳米材料、大蛋白质聚合体和生物囊泡[56]。

利用蛋白质免疫印迹和酶联免疫吸附分析技术可以对外泌体标志性蛋白质进行定性定量分析。其中蛋白免疫印迹是外泌体的经典表征手段之一,操作时往往需要细胞裂解液作为阴性对照。常用的外泌体标志性蛋白质包括四跨膜蛋白质CD63、CD81、CD9、肿瘤易感基因101蛋白(TSG101)、水通道蛋白2(AQP2,尿液中)和凋亡诱导因子6相互作用蛋白(Alix)等[57],内参蛋白质可以是肌动蛋白(β-Actin)或甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH),阴性对照蛋白可以是阻抑素(PHB,线粒体标志蛋白)[58]或钙联结蛋白Calnexin[56]。在酶联免疫吸附,析法中,外泌体裂解液通过固载有抗体的固相基质,随后与检测抗体共孵育。两种方法均存在操作繁琐、耗时长的问题,相比较而言,酶联免疫吸附分析法比蛋白质免疫印迹法更加快速,适用于高通量分析[5]。

流式细胞技术针对外泌体的表面抗原标记物进行检测,能够实现外泌体的高通量、多通道分析。但由于外泌体粒径小、折射率低,采用常规的流式细胞仪进行检测时往往需要将外泌体与beads连接以增大表面积、增强反射,操作耗时费力[54]。Tian等[59]搭建了一种高灵敏度的流式细胞仪(HSFCM),将可检测的外泌体粒径降至40 nm,能够在不连接beads的情况下实现每分钟10 000个外泌体的检测,并能够结合免疫荧光的方法进行外泌体标志蛋白质的定量检测,目前该仪器已商品化。

总之,虽然目前几种常用的表征方法尚有不足,但是多种方法结合能够提高对外泌体的表征精度。随着各项技术的发展,未来有望实现外泌体的准确、快速、可靠分析。

4 外泌体的生物学功能及其临床应用

4.1 外泌体的生物学功能

外泌体最初被认为是细胞排出代谢废物的一种方式,能够帮助缺乏高效降解能力或位于排泄系统的细胞排出不必要的蛋白质和RNA。近年来,随着人们对外泌体的深入了解,外泌体的多种生物功能先后被发现。如今外泌体作为一种细胞间交流、传递大量的生物功能分子的重要方式日益受到重视。外泌体与受体细胞的信息交流可能通过以下4种途径实现(见图4)[8,60]: (1)外泌体表面膜蛋白质被目的细胞表面的受体识别,从而激活靶细胞;(2)外泌体在蛋白酶作用下产生的表面膜蛋白质碎片可作为目的细胞表面受体的配体;(3)外泌体脂膜可以与目的细胞膜融合,将蛋白质和RNA等内容物释放进去,此类膜融合可能改变靶细胞的一些膜特性,例如脂质和膜蛋白质的密度及种类[61]; (4)目的细胞通过胞吞的形式摄入外泌体。

图 4 外泌体参与细胞间信息交流的4种途径Fig. 4 Four possible mechanisms of intercellular communication by exosomes

经由以上几种途径,外泌体将其携带的生物信息运输到周边靶细胞或经血液等体液运输而被远处组织细胞摄取,进而影响目的细胞的基本功能和基因表达。几乎所有的细胞都可以在自发或在一定刺激条件下产生外泌体,不同的细胞产生的外泌体具有不同的功能,这些外泌体参与了一系列生理和病理过程,如癌症发生与发展、抗原呈递、免疫调节、组织愈合等。

4.1.1正常细胞来源的外泌体

2007年,Valadi等[10]发现鼠源肥大细胞外泌体中的RNA可以转移至其他小鼠或人肥大细胞,并在受体细胞中翻译产生新的小鼠蛋白质,表明外泌体在细胞间mRNA和miRNA的传递中发挥重要作用,由此引起了人们对外泌体功能的极大关注。来自血细胞(包括血小板、白细胞和红细胞)的外泌体具有参与凝血、提供促血管生成因子、诱导血管生成等生理功能;妊娠期外泌体能够影响局部血管生成、调节分化、激活免疫、促进胚胎发育;肝脏细胞产生的外泌体有利于维护肝脏内稳态[62]。由此可见,正常细胞产生的外泌体对维持机体的正常生命活动起重要作用。而肿瘤细胞、免疫细胞、干细胞等特殊来源的外泌体由于具有独特的生物学功能,更加受到广泛关注。

4.1.2肿瘤细胞来源的外泌体

与正常细胞相比,肿瘤细胞外泌体的分泌量增多,内容物也存在明显差异[63]。由于囊泡结构的保护,肿瘤细胞来源的外泌体内携带有大量肿瘤细胞来源的活性生物分子,其特点包括[64]: (1)提供具有稳定构象的蛋白质分子;(2)保持蛋白质的生物活性;(3)携带其中的生物分子经体液运输至远端器官;(4)膜融合的作用方式使得肿瘤细胞来源的外泌体能够与靶细胞之间进行更有效的信息交流。以上特征使肿瘤细胞来源的外泌体成为肿瘤细胞与外界信息交流的一种理想方式,在肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用。

外泌体介导肿瘤转移:体外研究和体内成像实验表明恶性肿瘤细胞产生的外泌体可以在全身水平上被同一肿瘤或远端肿瘤中恶性程度较低的癌细胞摄入,其内所包含的与转移相关的mRNAs进入转移性较低的细胞后,能够增强其转移能力[65]。外泌体介导的肿瘤转移可能与多种作用机制相关。肿瘤细胞分泌的外泌体可以通过体液进入特定器官,建立有利于癌细胞生长的微环境,包括促进受体细胞上皮细胞-间充质转化、引发炎症、促进血管生成,为癌细胞的扩散形成有利条件。Lyden课题组[66-68]针对外泌体介导的肿瘤转移进行了一系列深入研究,发现转移性黑素瘤细胞产生的外泌体所包含的miR-200家族能够促进骨髓细胞的上皮细胞-间充质转化,导致肿瘤转移[68]。进一步研究发现肿瘤细胞外泌体能够引导癌症转移至特定器官,在膜表面特异性整合素的作用下,肿瘤细胞外泌体首先在特定的器官累积,引起受体器官产生炎症、生成血管,形成有利于肿瘤转移的微环境,使得肿瘤细胞更容易转移至该器官[66,67]。Maji等[69]揭示了恶性肿瘤细胞外泌体中的Annexin Ⅱ蛋白能够促进血管生成,为肿瘤转移创造有利的微环境。

外泌体介导肿瘤耐药性:肿瘤细胞来源的外泌体中某些miRNAs和non-coding RNAs (lncRNA)的变化在肿瘤化疗抗药性的发生发展中起重要作用。Qu等[70]研究发现lncRNA可以通过竞争性结合miR-34/miR-449,促进晚期肾细胞癌细胞中的跨膜受体酪氨酸激酶anexelekto (AXL)和tyrosine-protein kinase Met (c-MET)表达,引发舒尼替尼耐药。而外泌体能够将这一lncRNA运输至舒尼替尼敏感的癌细胞,从而传播舒尼替尼的抗性。外泌体中的miR21能够抑制卵巢癌细胞凋亡,并通过结合肌动蛋白丝相关蛋白凋亡酶激活因子(apoptotic protease activating factor 1, APAF1)使得卵巢癌细胞产生对紫杉醇的抗药性[71]。抗癌药物吉西他滨能够引起胰腺导管腺癌细胞中miRNA-155表达上调,上调的miRNA-155能够促进外泌体分泌并以此为载体向其他胰腺导管癌细胞输送miRNA-155,传播对吉西他滨的抗药性[72]。此外,多种外泌体来源的miRNAs可能与肺癌细胞对顺铂的耐药性相关[73]。

外泌体介导肿瘤免疫逃逸/免疫抑制:多项研究表明肿瘤细胞来源的外泌体能够抑制免疫相关的信号通路、阻碍机体对肿瘤的免疫响应。Chen等[74]研究发现黑色素瘤细胞、乳腺癌和肺癌细胞会产生携带程序性死亡分子1的配体(programmed cell death 1 ligand 1, PD-L1)的外泌体,此类外泌体在血液中循环,通过表面PD-L1与T细胞结合,导致T细胞在到达肿瘤细胞之前即受到抑制,达到远程干扰免疫细胞活性的效果。Chalmin等[75]则提出了肿瘤细胞来源的外泌体介导肿瘤免疫逃逸的另一种作用机制。他们的研究表明肿瘤来源的外泌体能够抑制骨髓来源的抑制性细胞(该细胞是树突状细胞(dendritic cells, DCs)、巨噬细胞和(或)粒细胞的前体,具有抑制免疫细胞应答的能力)对肿瘤的免疫监督。Wang等[76]发现肿瘤细胞来源的外泌体与巨噬细胞共孵育后,其内的miRNA-301a通过下调抑癌基因PTEN(phosphate and tension homo-logy deleted on chromsome ten),激活PI3Kγ(phosphoinositide 3-kinaseγ)信号分子,使巨噬细胞被“驯化”成为能参与抗炎反应、血管生成以及促进肿瘤生长转移的M2型巨噬细胞。该研究证实了外泌体中miR-301a在肿瘤免疫逃逸以及转移中的调控作用。

肿瘤细胞产生的外泌体除了具有上述参与肿瘤器官靶向转移、促进受体细胞上皮细胞-间充质转化、引发炎症、促进血管生成、改善肿瘤生长微环境、增强肿瘤耐药性以及介导肿瘤免疫逃逸等多种作用之外,还能够增强肿瘤细胞对放疗的耐受[77]、传递辐射诱导旁效应[78](见图5)。因此,对肿瘤细胞外泌体的分析和检测对于肿瘤的早期诊断、预后分析和疗效评价具有重要价值。

图 5 肿瘤细胞来源的外泌体在癌症发展过程中的作用[4]Fig. 5 Roles of tumor-derived exosomes in tumor progression[4]

4.1.3免疫细胞来源的外泌体

在免疫系统中,淋巴细胞、树突状细胞、巨噬细胞、肥大细胞等均可以产生外泌体。研究表明免疫细胞来源的外泌体能够显著影响机体的免疫调节机制,包括调节抗原呈递、免疫激活、免疫监督等。不同免疫细胞来源的外泌体功能不同,以树突状细胞(该细胞具有免疫刺激能力,是目前能够激活初始T细胞的唯一抗原递呈细胞)来源的外泌体为例,其外泌体的免疫刺激作用取决于来源细胞的成熟状态。成熟的树突状细胞外泌体内包含能够直接激活T细胞的MHC class Ⅰ和MHC class Ⅱ,共刺激分子如CD40、CD8、CD86和热激蛋白,这些分子使树突状细胞来源的外泌体具有抗原呈递、调节免疫响应的生物功能[79]。Zitvogel等[80]经体内和体外实验发现,小鼠骨髓树突状细胞产生的外泌体中含有的肿瘤多肽能够启动特异性细胞毒性T淋巴细胞,根除或抑制小鼠肿瘤的生长,这一发现为肿瘤免疫治疗提供了新的研究思路。另外,树突状细胞来源的外泌体也能够通过激活其他免疫细胞诱导抗肿瘤反应,从而抑制肿瘤[81]。

B细胞分泌的外泌体同样包含MHC Ⅱ-多肽复合物,能够激活人和小鼠抗原特异性T细胞,从而实现调节免疫响应的功能[36]。细菌或病原体感染的巨噬细胞外泌体能够刺激巨噬细胞和中性粒细胞分泌炎性介质,在增强机体免疫监督方面发挥重要作用[82]。肥大细胞来源的外泌体也能够参与机体免疫响应,包括促进B细胞和T细胞增殖,刺激产生细胞因子以及引发树突状细胞表型和功能成熟[83]。CD4+T细胞产生的外泌体同样具有免疫调节的作用[84]。

4.1.4干细胞来源的外泌体

由于外泌体能够反映其来源细胞的特性,不同干细胞来源的外泌体表现的生物功能也不尽相同,其中最受人们关注的一类干细胞外泌体来源于间充质干细胞。间充质干细胞存在于骨髓、脂肪、脐血、牙髓、滑膜液等部位,是一种能够自我更新的多功能干细胞。由于具有多向分化、促进组织修复、抗炎、免疫抑制和保护神经等功能,间充质干细胞在细胞治疗领域有着独特的优势。大量研究工作表明,间充质干细胞通过旁分泌的形式发挥其生理功能,而外泌体作为一种细胞间传递信息的介质,在间充质干细胞的功能行使中发挥了重要作用。研究发现间充质干细胞来源的外泌体能够修复组织损伤[85]、抑制肿瘤生长[86]和调节免疫响应[87],具有治疗心肌梗死、自身免疫疾病、阿尔兹海默症等疾病的潜力。

另外,也有研究[88]显示间充质干细胞来源的外泌体会促进某些肿瘤生长。但是由于外泌体蛋白质组学和基因组学方面的复杂性,加之干细胞具有多向分化的能力,干细胞来源外泌体的详细功能有待进一步挖掘,其作用机制也有待深入探究。

4.2 外泌体在疾病诊断中的应用

外泌体作为疾病诊断的标志物具有其独特优势:(1)与正常细胞相比,病变细胞产生的外泌体在分泌量和内容物方面存在明显差异。病变的细胞和组织能够产生更多外泌体[89],例如,癌症患者血液中外泌体的含量更高[54]。外泌体包含来源细胞多种特异性生物分子(蛋白质、脂质、核酸),这类特异分子有利于识别体液中外泌体的细胞来源。(2)由于特殊的生成方式,外泌体的组成不同于来源细胞。其内包含的一些特异性蛋白质能够揭示外泌体的起源、结构和运输方式,有利于深入了解外泌体的产生机制。另外,一些在细胞裂解液中难以检测到的、具有重要生物意义的低丰度蛋白质和膜蛋白质,在外泌体中丰度较高[90]。(3)病变细胞分泌的外泌体通过胞吐的过程进入血液、尿液等体液,囊泡状结构能够保护外泌体内部生物分子不受体液中蛋白酶、磷酸酶、核酸酶等干扰,有利于保持其结构完整和生物活性,通过对此类体液进行分析可以实现疾病的无创或微创检测。

血清和血浆为常规检测样本,具有微创取样的优点,是诊断疾病的理想样本。血液中外泌体能够作为胰腺癌[54]、胃癌[91]、肺癌[92]和阿尔兹海默[93]等疾病的早期诊断和疗效评价提供潜在标志物。血液外泌体来源的疾病标志物主要包括蛋白质和miRNA两类。Melo等[54]发现利用胰腺癌细胞外泌体表面的磷脂酰肌醇聚糖-1(GPC1)能够实现胰腺癌早期诊断,利用该方法对血清中包含GPC1的外泌体进行检测,能够高特异性(100%)、高灵敏度(100%)地区分胰腺癌患者(246例)和正常人(20例)以及慢性胰腺炎患者(37例)。Taylor等[94]的研究结果显示卵巢癌患者与良性卵巢疾病患者血清外泌体中的miRNA表达谱有明显差异,表明血清外泌体中的miRNA可以作为卵巢癌活检的替代诊断标志物。多项研究[95-97]表明外泌体中的miR-21在包括大多数癌症的多种病理条件下过度表达。

尿液外泌体来源于泌尿系统相关的各种细胞,包括肾小球足细胞、肾小管细胞和膀胱等,因此尿液外泌体数目、形态和生化性质的改变往往反映泌尿系统疾病。Widmark等[98]通过对前列腺癌症患者尿液中的外泌体进行转录组分析,鉴定到两种已知的前列腺癌症标志物PCA-3 (prostate cancer antigen 3,前列腺癌抗原3)和TMPRSS2: ERG (the fusion gene of transmembrane protease serines to ERG,跨膜蛋白酶丝氨酸与ERG的融合基因),表明尿液外泌体具有诊断和监测癌症患者状态的潜力。除已知的疾病标志物,Rodríguez等[99]通过对28例前列腺癌症患者和19例正常人尿液外泌体中的miRNA进行深度测序分析,发现两种miRNA(miR-196a-5p和miR-501-3p)在前列腺癌患者组明显下调,表明尿液外泌体中的特异性miRNA可能作为前列腺癌的新型生物标志物。Khurana等[100]将研究对象由miRNAs扩大至多种类型RNA,通过对慢性肾病患者尿液外泌体中各类RNA进行系统研究,在慢性肾病患者组中识别出30种显著差异的lncRNAs,表明尿液外泌体中的lncRNAs具有作为慢性肾病早期诊断标志物的潜力。Skotland等[101]的研究则表明尿液外泌体中的脂质能够作为前列腺癌的新型标志物,3种脂质标志物结合使用能够有效提高对前列腺癌的诊断灵敏度(93%)和特异性(100%)。

除血液和尿液外,其他体液中包含的病变细胞来源的外泌体也有可能成为疾病的重要标志物。唾液中包含来自于唾液腺上皮体外细胞的外泌体,Michael等[102]从唾液中提取外泌体,并对唾液外泌体中的miRNA进行分析,发现此类miRNA有望作为成为唾液腺疾病的生物标志物。Wu等[103]成功从汗液中提取得到外泌体,并进行蛋白质组学分析,在汗液外泌体中共鉴定到1 062种蛋白质,其中包含多种抗菌肽和免疫因子,表明汗液外泌体参与皮肤免疫。Liu等[104]从患有阿尔兹海默症患小鼠的脑脊髓液中提取得到外泌体,并与野生型小鼠进行对比,发现实验组miR-193b显著下调,该结果与血液外泌体结果一致。

由此可见,外泌体来源的内容物可作为多种疾病的潜在标志物,为临床诊断提供有用信息。通过对体液中外泌体进行检测,更是能够以无创或微创的方式实现疾病诊断,具有良好的应用前景。

4.3 外泌体在疾病治疗中的应用

4.3.1外泌体用于癌症免疫治疗

基于免疫细胞来源的外泌体能够介导和调节机体对肿瘤的免疫反应,外泌体在肿瘤免疫治疗方面的潜力受到广泛关注。其中树枝状细胞产生的外泌体包含大量的MHC-多肽复合物和免疫刺激相关的分子,能够激活相关的T细胞,介导体内抗肿瘤应答,在多个临床试验中表现出良好的抗肿瘤疗效[105]。Morse等[105]考察了树枝状细胞外泌体对非小细胞肺癌患者的疗效。结果表明,患者对树枝状细胞外泌体耐受性良好,1/3患者表现出了对树枝状细胞外泌体的T细胞响应,2/4患者自然杀伤细胞活性得以激活。Escudier等[106]公布了利用自体树突状细胞外泌体免疫治疗转移性黑色素瘤的临床一期试验结果,发现自体树突状细胞外泌体无明显毒性,并且具有刺激自然杀伤细胞的能力。以上临床试验证明了外泌体免疫疗法的安全性和可行性,为进一步临床研究奠定了基础。

4.3.2外泌体作为药物载体

由于特殊的结构和循环方式,外泌体作为药物运输的载体具有独特的优势。例如外泌体的尺寸分布能够增强渗透滞留效应,从而有选择性地深入肿瘤组织;其外层磷脂双分子层可以保护内容物不受各种生物酶的影响,维持各种生物分子的活性;外泌体普遍存在于各种体液和组织中,其体积小,结构、组成与细胞膜类似,导致外泌体可以在避开免疫系统监督的同时深入组织内部,有较好的生物相容性;当采用内源外泌体时,能明显降低其他药物载体可能引起的有害免疫反应;除此之外,某些细胞来源或经特殊修饰过的外泌体具有良好的特异性,可以与特定的器官或组织结合[107]。因此,载药成为外泌体研究的一个重要分支,具有良好的应用前景。

在外泌体中引入药物的方式包括体内装载和体外装载两种。体内药物装载可以通过传统方法(如病毒转染、脂质体转染或电穿孔等)转染来源细胞,编码感兴趣的RNA或蛋白质,也可以使药物与来源细胞共混,使细胞分泌产生含有目标生物分子的外泌体。体外药物装载则首先需要得到纯化的外泌体,然后将感兴趣的药物通过电穿孔或脂质体转染等方法装入纯化的外泌体。外泌体内可装载的药物包括小分子化学药物[108,109]、蛋白质和多肽[110]、核酸药物[111]、天然产物[112]等。

Pascucci等[108]将包含有紫杉醇的间充质细胞来源外泌体与胰腺癌细胞共培养,发现装载紫杉醇的间充质细胞外泌体具有很强的抗肿瘤增殖效果。Tian等[109]为降低免疫原性与毒性,采用小鼠未成熟树突状细胞所产生外泌体作为药物载体。同时为实现外泌体运输的靶向性,使细胞表达能够识别乳腺癌细胞的外泌体膜蛋白Lamp2b (lysosomeassociated membrane glycoprotein 2b,溶酶体相关膜蛋白2)。并采用电穿孔的方法,在纯化所得的小鼠未成熟树突状细胞外泌体中载入阿霉素。结果表明该外泌体能够特异性的将阿霉素传递给肿瘤组织,抑制肿瘤生长且无明显毒性。Haney等[110]将用于治疗帕金森氏综合征的过氧化氢酶包入外泌体,能够明显提高药物载入的效率,维持药物的持续释放,具有显著的神经保护作用。研究表明多种miRNA(例如miR-124)有助于修复神经系统损伤,然而由于核酸易于降解,加之大部分小分子难以通过血脑屏障,使得核酸药物难以发挥作用。Yang等[111]利用外泌体能够通过血脑屏障这一天然优势,并进一步将狂犬病病毒糖蛋白与外泌体溶酶体相关的膜蛋白融合,经改造后的外泌体能够靶向地将miR-124运输至脑梗部位,对修复缺血性损伤神经有显著效果。Zhuang等[112]通过自组装的方法将姜黄素装入外泌体中,用于增强药物的抗炎性。外泌体不仅能够增加疏水性天然药物的溶解度、稳定性和生物利用度,也能够提高姜黄素的传输效率。由此可见,外泌体作为一种新型的药物载体具有广泛的应用前景。

如今,伴随对外泌体分泌机制、功能的深入了解,人们意识到外泌体作为细胞间通讯的重要介质,不仅参与生物体内正常的生理功能,还涉及某些疾病的发病机理,包括肿瘤、心血管疾病和神经退行性疾病等。外泌体被认为是疾病的生物标志物和预后因子,加之能够作为基因和药物递送的载体,具有重要的临床诊断和治疗意义。

5 展望

外泌体作为细胞间信息交流的重要介质,既对维持机体的正常生命活动起重要作用,也在肿瘤、免疫、组织修复等领域发挥独特的生物学功能,因而受到广泛关注。随着研究的不断深入,外泌体的各项功能逐渐被挖掘,越来越多的分离提取技术不断涌现。但目前依然存在着一些重大问题与挑战,例如不同细胞来源外泌体在机体内的作用机制尚不明确;尚无一种方法能够同时实现外泌体快速、高效、高纯度、无损伤的提取,难以满足目前科研和临床的需求。虽然如此,随着分离和检测技术的不断开发、融合,外泌体在不同领域的诸多潜能终将会被发掘。