离子交换固相萃取-气相色谱-质谱联用法测定方便面皮复合包装袋中2,4-二氨基甲苯的迁移量

芦智远, 王 冰, 田 娜, 张耀武*, 张新宇, 刘 佳, 吕 岩

(1. 西安市产品质量监督检验院, 陕西 西安 710065; 2. 西安计量技术研究院, 陕西 西安 710086)

面皮是我国传统的特色小吃,随着食品工业的发展,在保留传统工艺基础上,增加真空包装、巴氏杀菌等生产工艺,面皮行业已逐步摆脱了无包装、保质期短的缺点,实现了面皮产业的工业化、速食化。但在真空包装过程中,引入复合包装材料带来的食品安全隐患,也应引起足够的重视。复合食品包装材料的生产,一般需要用到含有甲苯二异氰酸酯(TDI)的黏合剂,TDI极易发生水解,生成芳香胺类化合物2,4-二氨基甲苯[1],相关研究表明2,4-二氨基甲苯对黏膜、呼吸道及皮肤有刺激作用,中毒表现有支气管炎、气管炎、喘息等,人体长期接触可能致癌、致基因突变[2]。

方便面皮标签明示的食用方法一般包括蒸、水煮和微波3种加热方式,其中水煮和微波加热法是将面皮连同内包装袋一起加热,这就加快了包装材料中2,4-二氨基甲苯向食品的迁移。本文拟建立一套高效准确的2,4-二氨基甲苯迁移量的检测方法,并应用于采集样本的检测,调研目前面皮行业包装材料中2,4-二氨基甲苯的污染情况。

针对2,4-二氨基甲苯迁移量的检测,从2003年国家卫生部发布的GB/T 5009.119-2003[3]到2016年发布的GB 31604.23-2016[4],国标方法由气相色谱法已逐步向气相色谱-质谱联用的方向发展。除此以外,还有近年来文献报道的气相色谱法[5-11]、液相色谱法[12]、气相色谱-质谱联用法[13-16]等,但以上检测方法的前处理过程主要是利用氨基碱性的性质,对迁移溶液碱化处理,液液萃取将分子态的2,4-二氨基甲苯提取至有机相。然而液液萃取的提取方式操作繁琐,有机试剂消耗量大,同时萃取效果也易受pH值的影响。解伟欣等[17]应用反相固相萃取技术对二氨基甲苯进行浓缩富集,但是为了增强二氨基甲苯在反相固相萃取柱上的保留,过柱前仍需碱化处理。因此,简化提取操作流程依旧是目前2,4-二氨基甲苯迁移量检测的难点。

离子交换型固相萃取技术具有针对性强、操作简单、高效、有机试剂消耗量少等优势,目前,将离子交换型固相萃取应用于2,4-二氨基甲苯的检测方法暂无报道,本文拟采用混合型强阳离子交换柱浓缩净化迁移溶液,利用磺酸基对碱性化合物良好的保留性质,解决在酸性条件下反相吸附剂对2,4-二氨基甲苯无法吸附保留的问题,简化前处理过程,再结合GC-MS定性准确的优点,建立一套离子交换固相萃取-气相色谱-质谱联用法测定方便面皮复合包装袋中2,4-二氨基甲苯迁移量的检测方法。

1 实验部分

1.1 仪器与设备

GCMS-QP2010SE气相色谱-质谱联用仪(日本岛津公司); Milli-Q超纯水器(美国Millipore公司); AUTOTRACE 280固相萃取仪(美国Dionex公司); MTN-2800D氮吹仪(天津奥特赛恩斯仪器有限公司); DHG-9140A烘箱(上海一恒科学仪器有限公司)。

1.2 材料与试剂

碳酸氢钠、冰乙酸为分析纯(科密欧化学试剂有限公司);氨水为分析纯(成都市科龙化工试剂厂);乙酸乙酯、甲醇为色谱纯(美国霍尼韦尔公司); MCX固相萃取柱(200 mg, 6 mL)、HLB固相萃取柱(200 mg, 6 mL)、C18固相萃取柱(500 mg, 6 mL),购于美国Waters公司;2,4-二氨基甲苯标准品(纯度99.0%)购于德国Dr. Ehrenstorfer公司;七氟丁酸酐(纯度98.0%)购于玛雅试剂有限公司。

2,4-二氨基甲苯标准溶液配制:准确称取10 mg(精确至0.1 mg)2,4-二氨基甲苯,用乙酸乙酯定容至100 mL,配制成质量浓度为100 mg/L的标准储备液,于4 ℃条件下保存。用乙酸乙酯稀释至1 mg/L,得2,4-二氨基甲苯标准使用液。再用乙酸乙酯将标准使用液稀释成1、5、10、25、50 μg/L的标准工作液。

1.3 前处理方法

1.3.1迁移试验

参照GB 31604.23-2016,移出面皮内包装袋中全部食品,用水冲洗内包装袋至无污物,再用水洗3次,淋干。按照2 mL/cm2(内表面积)装入乙酸溶液,热封口,置于120 ℃±5 ℃条件下恒温40 min。迁移试验结束后,自然冷却至室温,剪开封口,将溶液转移至干燥烧杯中备用。

1.3.2净化与富集

选用MCX固相萃取柱。活化溶剂:5 mL甲醇;平衡溶剂:5 mL水;淋洗溶剂:5 mL水;洗脱溶剂:3 mL 5%(v/v)氨化甲醇。上样量:50.0 mL。活化流速:3 mL/min;平衡流速:3 mL/min;上样流速:10 mL/min;淋洗流速:3 mL/min;洗脱流速:3 mL/min。淋洗后吹干2 min,待固相萃取仪运行结束后,收集洗脱液,混匀,在40 ℃下氮吹至近干,用乙酸乙酯定容至2 mL,混匀后待衍生处理。

1.3.3衍生处理

在上述复溶液中加入50 μL七氟丁酸酐,轻轻混匀,室温下衍生10 min后,加入4 mL 20 g/L碳酸氢钠溶液,混匀,待静置分层后,取有机层待GC-MS分析。

1.3.4标准测定液的制备

取2,4-二氨基甲苯标准工作液2 mL,加入50 μL七氟丁酸酐按照1.3.3节步骤进行衍生处理,取有机层待GC-MS分析。

1.4 GC-MS条件

1.4.1气相色谱条件

毛细色谱柱:DB-5MS(30 m×0.25 mm, 0.25 μm);进样口温度:250 ℃,进样方式:不分流;载气(He)流速:1.2 mL/min;程序升温:起始温度80 ℃,保持1 min,以15 ℃/min的升温速度至250 ℃,保持2 min;进样量:1 μL。

1.4.2质谱条件

轰击电子能量:70 eV; EI源温度:200 ℃;接口温度:280 ℃;溶剂延迟:6 min;选择离子:m/z514、m/z345和m/z317。

2 结果与讨论

2.1 衍生剂条件的选择

七氟丁酸酐可与2,4-二氨基甲苯上的两个氨基发生衍生化,改善目标物的气相色谱行为。以50 μg/L的2,4-二氨基甲苯标准溶液为样本,以衍生产物在GC-MS上的相应强度为指标,分析比较不同衍生条件对衍生效果的影响。

图 1 七氟丁酸酐用量对2,4-二氨基甲苯衍生效果的影响(n=3)Fig. 1 Effect of amount of heptafluorobutyric anhydride on the derivatization of 2,4-diaminotoluene (n=3)

2.1.1衍生剂用量对衍生效果的影响

在衍生过程中,固定其他衍生条件不变,考察不同衍生剂用量对衍生效果的影响。取2 mL 50 μg/L的二氨基甲苯标准溶液,分别加入30、50、80、150 μL七氟丁酸酐,40 ℃条件下衍生10 min,每个水平做3次平行试验,测定结果见图1。结果表明,当衍生剂用量大于50 μL时,峰面积增加不明显,故由此确定衍生剂的添加量为50 μL。

2.1.2衍生时间对衍生效果的影响

在40 ℃条件下,在2 mL 50 μg/L的二氨基甲苯标准溶液中添加50 μL七氟丁酸酐,分别衍生2、5、10、15、30 min,每个水平做3次平行试验,测定结果见图2。由图2可见,七氟丁酸酐与2,4-二氨基甲苯的衍生化反应主要发生在前10 min以内,10 min后数据平稳,因此确定衍生时间为10 min。

图 2 衍生时间对2,4-二氨基甲苯衍生效果的影响(n=3)Fig. 2 Effect of time on the derivatization of 2,4-diaminotoluene (n=3)

2.1.3衍生温度对衍生效果的影响

取2 mL 50 μg/L的二氨基甲苯标准溶液,添加50 μL七氟丁酸酐,分别在20、30、40、60 ℃条件下衍生10 min,每个水平做3次平行试验,测定结果见图3。试验发现,随着衍生温度的提高,峰面积相应升高,当衍生温度超过40 ℃,峰面积趋于稳定,故本方法选用40 ℃作为衍生温度。

图 3 衍生温度对2,4-二氨基甲苯衍生效果的影响(n=3)Fig. 3 Effect of temperature on the derivatization of 2,4-diaminotoluene (n=3)

2.2 固相萃取柱的选择

使用C18、HLB分别在4%(v/v)乙酸溶液(pH 2.5)和pH 8.0(碱化)条件下考察这两种类型的固相萃取柱对2,4-二氨基甲苯的保留效果,同时在4%(v/v)乙酸溶液(pH 2.5)条件下,评价MCX小柱对2,4-二氨基甲苯的富集能力。各类型固相萃取柱的使用方法如下:HLB和C18小柱分别以5 mL甲醇、5 mL水活化平衡,上样50 mL(加标质量浓度50 μg/L),用5 mL水淋洗、3 mL甲醇洗脱;MCX小柱以5 mL甲醇、5 mL水活化平衡,上样50 mL,用5 mL水淋洗、3 mL 5%(v/v)氨化甲醇洗脱。分别收集C18、HLB和MCX小柱的洗脱液,氮吹至近干,用乙酸乙酯定容至2 mL,混匀,加入50 μL七氟丁酸酐,40 ℃衍生10 min后,加入4 mL 20 g/L碳酸氢钠溶液,混匀,待静置分层后,取有机层待GC-MS分析,测定结果见图4。

图 4 固相萃取柱对2,4-二氨基甲苯回收率的影响Fig. 4 Effect of SPE cartridges on the recovery of 2,4-diaminotoluene

结果发现,若将乙酸体积分数为4%的迁移溶液直接过柱,C18、HLB对2,4-二氨基甲苯均无保留,但是若将迁移溶液先进行碱化处理后再上样,目标的回收率得到显著提升;而MCX型固相萃取柱即使在酸性条件下(4%(v/v)乙酸),目标物的回收率也非常高。分析原因,这是因为2,4-二氨基甲苯的分子结构是由两个氨基取代了甲苯2、4位的氢,这使得该化合物具备了亲水和亲脂的双重特征,由于迁移试验是在4%(v/v)乙酸溶液中完成的,受溶液pH环境影响,2,4-二氨基甲苯基本以离子形态存在,因此无法直接使用烷基柱或二乙烯苯柱对2,4-二氨基甲苯进行保留。MCX柱属于混合型阳离子交换柱,磺酸基对碱性化合物具有良好的保留能力,与二乙烯苯的亲脂基团协同作用,因此不再受pH值的影响,可以有效地富集目标物。因此,确定选择MCX混合型阳离子交换柱。

2.3 洗脱体积的确定

洗脱是固相萃取技术中的关键环节,洗脱液用量过大会影响检测的工作效率,用量过小会导致目标物的回收率不高。以50 mL 4%(v/v)乙酸溶液(加标质量浓度50 μg/L)模拟迁移溶液,固相萃取柱依次经活化、平衡、上样、淋洗除杂后,分别加入1.0、2.0、3.0、4.0 mL 5%(v/v)氨化甲醇洗脱,考察洗脱溶剂体积对目标物回收率的影响,结果见图5。

图 5 洗脱体积对2,4-二氨基甲苯回收率的影响Fig. 5 Effect of elution volume on the recovery of 2,4-diaminotoluene

结果表明,当洗脱液体积超过3.0 mL时,回收率达到92.28%,且基本保持不变,说明此时2,4-二氨基甲苯已经完全洗脱,因此确定洗脱液的体积为3.0 mL。

2.4 二氨基甲苯的质谱分析

2,4-二氨基甲苯与衍生剂七氟丁酸酐反应生成2,4-二(七氟丁酰氨基)甲苯,反应式见图6。在电子轰击能量70 eV、全扫描采集模式条件下,设置质量扫描范围为40～550 u, 2,4-二(七氟丁酰氨基)甲苯质谱分析得到的全扫描质谱图见图7。

图 6 2,4-二氨基甲苯与七氟丁酸酐的反应式Fig. 6 Reaction of 2,4-diaminotoluene with heptafluorobutyric anhydride

图 7 2,4-二(七氟丁酰氨基)甲苯的全扫描质谱图Fig. 7 Full scan spectrum of 2,4-bis(heptafluoro-butylamide) toluene

2,4-二氨基甲苯的衍生物2,4-二(七氟丁酰氨基)甲苯的相对分子质量为514,经离子源轰击后,产生分子离子碎片m/z514(失去电子)、m/z345(失去C3F7)、m/z317(失去电子COC3F7)等(见图8),根据丰度,选择m/z345作为定量离子,m/z514、m/z317为参比离子。

图 8 2,4-二(七氟丁酰氨基)甲苯离子碎片的推导Fig. 8 Derivation of ion fragments of 2,4-bis(heptafluorobutylamide) toluene

2.5 方法学评价

2.5.1线性范围、检出限与定量限

对质量浓度分别为1、5、10、25、50 μg/L的标准工作液按照1.4节色谱及质谱条件建立峰面积(y)与质量浓度(x, μg/L)的线性关系,结果表明,2,4-二氨基甲苯在1～50 μg/L质量浓度范围内线性良好,线性方程为y=1 154x-645,线性相关系数(r)为0.999 1。选取未检出2,4-二氨基甲苯的包装袋浸泡液为空白基质,在5 μg/L的添加水平下,以3倍信噪比计算方法的检出限,10倍信噪比计算定量限,当取样量50.0 mL,定容体积为2 mL时,2,4-二氨基甲苯的检出限为0.2 μg/L,定量限为0.6 μg/L。

2.5.2回收率和精密度实验结果

在空白基质浸泡液中添加1 mg/L的2,4-二氨基甲苯标准使用液,配制成1、10、50 μg/L 3个水平的加标样品,进行样品加标试验,每个水平测定6次,计算回收率及精密度。结果表明,本方法的平均回收率在89.0%～94.2%之间,相对标准偏差为1.9%～3.6%。回收率和精密度均能满足定量要求,实验结果见表1。

表 1 2,4-二氨基甲苯在样品中的加标回收率和精密度(n=6)

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2.6 实际样品测定

面皮行业的发展已规模化、产业化,如陕西关中的宝鸡、西安等地,生产企业及小作坊数量众多。使用本文建立的检测方法对采集到的67份方便面皮复合包装袋样品进行检测(样本包括陕西生产企业32家、小作坊17家、超市自封2份、辽宁3份、甘肃3份、北京2份、河北1份、山西1份、广东1份、四川2份、河南1份、福建2份等),其中两个样品2,4-二氨基甲苯的结果呈阳性,分别为1.4 μg/L和0.8 μg/L,但符合GB 9683-88《复合食品包装袋卫生标准》[18]限量要求(≤0.004 mg/L),其余65个样品未检出2,4-二氨基甲苯。

3 结论

本文建立了离子交换固相萃取-气相色谱-质谱联用法测定方便面皮复合包装袋中2,4-二氨基甲苯迁移量的检测方法,采用MCX混合型阳离子交换柱,利用其磺酸基对碱性化合物良好的保留性质,对迁移溶液中的2,4-二氨基甲苯进行富集和净化。该前处理方法相较已报道的2,4-二氨基甲苯迁移量的检测方法[4-16],无需调节迁移溶液的pH值,迁移溶液可以直接过柱进行目标物的浓缩。该方法大幅度缩短了前处理时间,减小了有机溶剂的使用量,操作便捷,结果准确可靠,适用于方便面皮复合包装袋中2,4-二氨基甲苯迁移量的检测。