高效液相色谱法同时测定血塞通片中5种皂苷类成分含量*

李 敏，叶 慧，陈骁鹏，姜 玮，吴 芸

（江苏省泰州市食品药品检验所，江苏 泰州 225300）

图1 高效液相色谱图

血塞通片主要成分为三七药材中的三七总皂苷，有活血祛瘀、通脉活络功效，其现行标准[1]含量测定项以紫外-可见分光光度法测定三七总皂苷的含量[2]。本研究中建立了高效液相色谱（HPLC）法同时测定血塞通片中5种皂苷类成分的含量。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

WatersAcquityArc高效液相色谱仪，包括Empower3工作站、四元梯度泵、2998型二极管阵列检测器、自动进样器和柱温箱（美国Waters公司）；8200型超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）；Milli-Q型超纯水处理系统（美国Millipore公司）；XS105DU型电子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

1.2 试药

三七皂苷R1对照品（批号为110745-201318，含量94.0%），人参皂苷 Rg1对照品（批号为 110703-201530，含量 91.7%），人参皂苷 Re对照品（批号为110754-201626，含量 97.4%），人参皂苷 Rb1对照品（批号为110704-201424，含量93.7%），人参皂苷 Rd对照品（批号为111818，含量92.1%），均购自中国食品药品检定研究院；血塞通片（云南安特呐制药股份有限公司，批号分别为 170516、160412、170937；湖南湘雅制药有限公司，批号为1704101；昆药集团血塞通药业股份有限公司，批号为161227；湖南绅泰春药业有限公司，批号为 20150701、20160301）；乙腈为色谱纯，甲醇为分析纯，水为超纯水。

2 方法

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：XBridge C18柱（250 mm ×4.6 mm，3.5 μm）；流动相：乙腈溶液（A）-水（B），梯度洗脱（0～20 min 时20%A，20～45 min时 20%A→46%A，45～55 min时46%A→55%A，55～60 min时 55%A，60～62 min时55%A→20%A，62～70min时 20%A）；流速：1.0mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：203 nm；进样量：10 μL。各相邻成分之间分离度较好（R＞1.5），理论板数按人参皂苷Rg1峰计应不低于5 000。

2.2 溶液制备

称取各对照品适量，精密称定，加甲醇制成含三七皂苷 R1、人参皂苷 Rg1、人参皂苷 Re、人参皂苷 Rb1、人参皂苷Rd的混合对照品溶液。取样品10片，除去包衣，称定质量，研细，混匀，取约40 mg，精密称定，置10 mL容量瓶中，溶解并定容，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。按样品处方取缺三七总皂苷的适量赋形剂制成阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照溶液。

2.3 方法学考察

专属性试验：取2.2项下混合对照品溶液及阴性对照溶液，按2.1项下色谱条件进样分析，记录色谱图。结果，在各待测成分峰处阴性对照无干扰，详见图1。

线性关系考察：取混合对照品溶液适量，加甲醇稀释成不同质量浓度，按2.1项下色谱条件分别进样10 μL，记录峰面积，以峰面积（Y）为纵坐标、进样量（X，mg）为横坐标进行线性回归。结果见表1。

表1 5个成分线性关系考察结果（n=3）

定量限与检测限考察：精密吸取混合对照品溶液适量，加甲醇逐级稀释，进样测定，以信噪比（S/N）≥10测定各成分定量限，以S/N≥3测定各成分检测限。结果见表1。

精密度试验：取2.2项下混合对照品溶液，按2.1项下色谱条件，连续进样6次，记录峰面积。结果三七皂苷R1及人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd色谱峰面积的RSD分别为 0.34% ，0.25%，0.23% ，0.26%，0.24% （n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：吸取同一供试品溶液（批号为170516），室温下分别放置 0，2，4，8，12，16，20，24h 时按 2.1 项下色谱条件进样，记录峰面积。结果三七皂苷R1及人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd 的色谱峰面积的RSD分别为 0.83% ，0.56%，1.23%，0.78%，1.04%（n=8），表明供试品溶液室温下放置24h内稳定。

重复性试验：取同一批样品（批号为170516）6份，依法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算含量。结果三七皂苷R1及人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd 的平均含量分别为每片 9.74，33.75，4.51，34.18，8.75 mg，RSD分别为 1.00% ，0.87% ，1.82% ，0.82%，0.77%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取已知含量的样品（批号为170516），研细，称取6份，每份约20 mg，精密称定，再精密加入一定质量浓度的混合对照品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，计算回收率。结果见表2。

表2 加样回收试验结果（n=6）

2.4 样品含量测定

取7批样品，依法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，以外标法计算样品中5种成分的含量。结果见表3。

表3 样品含量测定结果（n=3）

3 讨论

采用甲醇作为提取溶剂，分别超声30 min和直接溶解，进样，比较峰面积，结果直接溶解的提取率更高，可能是由于超声过程中皂苷类分解加速，故选用直接溶解[3-4]。分别称取 10，20，30，40，50 mg 样品，直接溶解，进样，比较峰面积，结果40 mg的提取效率最高。

2015年版《中国药典（二部）》西洋参药材检测中以乙腈-0.1%磷酸溶液梯度洗脱，结果人参皂苷Rd出峰太快，分离度差，且分离时间过长。查阅有关文献[5-7]，发现大多选用乙腈-水为流动相，同时血塞通片以三七总皂苷为原料药，样品色谱图中杂质峰相对较少，考虑到人参皂苷Rg1和人参皂苷Re分离度不佳，以及人参皂苷Rd极性小、出峰时间晚的问题，通过对梯度洗脱程序的调整，最终选用70 min的梯度洗脱系统。

综上所述，本HPLC法简便可行，准确可靠，重复性好，结果稳定，可用于血塞通片中5种皂苷类成分的同时测定。