四波长融合指纹图谱评价金卷升板胶囊质量*

王玲娇 ，杨 亮 ，张振杰，于 静△，杨继章，孙国祥，周春华

（1.河北医科大学第一医院，河北 石家庄 050031； 2.沈阳药科大学药学院，辽宁 沈阳 110016）

金卷升板胶囊源自河北医科大学第一医院血液科刘清池主任医师经验方，由金银花、黄芩、地锦草、熟大黄等中药材组方，有解毒散瘀、清热凉血、止血通络功效，主治原发性免疫性血小板减少症（ITP）[1-2]。现有文献多报道以高效液相色谱（HPLC）法测定处方中单味药材代表成分及建立单味药材单波长指纹图谱[3-4]，未见该制剂的指纹图谱报道。多波长融合指纹图谱可清晰、完整地揭示处方中有效成分的复杂物质基础，现已用于中药成分分析[5-6]。本研究中建立了金卷升板胶囊的四波长融合指纹图谱，并对其质量进行全面评价。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

1200 Series型高效液相色谱仪（美国 Agilent公司）；BS 110S型分析天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司）；KQ-400KDE型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；微孔滤膜（上海兴亚净化材料厂）。

1.2 试药

没食子酸对照品（批号为110710-200110，含量98%），绿原酸对照品（批号为110756-200102，含量98%），黄芩苷对照品（批号为110755-200103，含量98%），芦荟大黄素对照品（批号为110796-200802，含量98%），大黄素甲醚对照品（批号为110724-200613，含量98%），均购自中国食品药品检定研究院；金卷升板胶囊（河北医科大学第一医院，批号分别为170813、170826、170901、170914、170928、170834、170841、170855、170935、170959、170968，编号依次为 S1～S11，规格为每粒0.5 g）；甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Diamonsil C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：0.5% 乙酸水（A）-甲醇（B），梯度洗脱（0～10 min时 10%B→40%B，10～40 min时 40%B→70%B，40～55 min时 70%B→100%B，55～65 min时 100%B）；检测波长：254，275，330，360 nm；柱温：30 ℃；流速：1 mL/min；进样量：10 μL。

2.2 溶液制备

分别取没食子酸对照品1.34 mg，绿原酸对照品6.19 mg，黄芩苷对照品6.46 mg，芦荟大黄素对照品1.81 mg，大黄素甲醚对照品3.21 mg，精密称定，置25 mL容量瓶中，加甲醇定容，摇匀，得混合对照品溶液。取样品内容物10粒，混匀，研细，取0.2 g，精密称定，置10 mL容量瓶中，加入约10 mL 70%甲醇，超声（功率300 W，频率40 Hz）处理30 min，降至常温后，加70%甲醇定容，摇匀，滤过，得供试品溶液。

2.3 方法学考察

按标准进行方法学考察，结果精密度、稳定性、重复性试验的RSD均小于3%，表明仪器精密度、方法重复性均良好，供试品室温下放置24 h内稳定。

2.4 四波长融合指纹图谱分析

融合指纹图谱建立：取11批样品，依法制备11批供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定，得HPLC图谱，导入中药色谱指纹图谱超信息特征数字化评价系统4.0版软件，得HPLC指纹图谱（见图1）。以黄芩苷峰为参照物峰，确定65个共有峰，其中5号峰为没食子酸峰，12号峰为绿原酸峰，37号峰为黄芩苷峰，49号峰为芦荟大黄素峰，64号峰为大黄素甲醚峰，按照平均值法生成对照指纹图谱（RFP），见图1。

金卷升板胶囊质量评价：以生成的对照指纹图谱为标准，采用系统指纹定量法依次计算11批样品的宏定性相似度（Sm）、宏定量相似度（Pm）、均化系数（α）值，并区分金卷升板胶囊归属的质量等级（见表1）。结果11批样品均为合格品。

图1 11批金卷升板胶囊指纹图谱与对照指纹图谱（RFP）

表1 金卷升板胶囊指纹质量评价结果

两种指纹图谱质量评价结果比较：不同批次的金卷升板胶囊样品在融合后和4个单波长下分别建立对照指纹图谱，采用系统指纹定量法评价质量（见表1）。结果表明，指纹信号均化性与对照指纹图谱差异较小，但单波长处指纹信息的不全会导致质量等级评价一致性偏好，且区分度小，而综合了特征图谱的融合谱的质量等级除S10外，其余均有所下降，但能更好地区别不同样品的质量等级，使试验结果更客观真实。

3 讨论

3.1 样品提取方法选择

预试验比较了乙醇超声提取法、浸泡法和回流提取法对有效成分的影响，结果回流提取法和浸泡法的指纹图谱峰数量在4个检测波长处均少于超声提取法，且回流温度过高，浸泡时间过长均导致主要成分相对含量下降，部分成分被破坏和分解，故最终选择超声法进行提取。

3.2 样品提取溶剂选择

预试验中，比较了不同比例的甲醇、乙醇在超声条件下提取的结果，发现甲醇提取的供试品溶液的色谱峰及分离度均优于乙醇，因此采用甲醇进行提取。70%甲醇提取的样品在各个波长的主要成分色谱峰面积均大于30%甲醇、50%甲醇及80%甲醇，故选择70%甲醇作为提取溶剂。

3.3 融合指纹图谱检测波长确定

预试验中对组方有效成分进行全波长扫描，最终选取254，275，330，360 nm这4个特征波长处的色谱图进行融合。将11批样品在4个波长下的色谱信号分别导入中药色谱指纹图谱超信息特征数字化评价系统4.0版软件[7-9]，以获取较好的相似度和合适的指纹峰为评价标准，选取软件计算的最大值在融合时间窗0.2 min时融合4个检测波长下的色谱图，得金卷升板胶囊各批次的融合指纹图谱。

综上所述，基于多波长融合技术的系统指纹定量法可为金卷升板胶囊的质量评价提供参考。