响应面法优化商陆多糖提取工艺研究

郭旭，陈乃东

（1.皖西学院生物与制药工程学院，安徽六安237012；2.安徽省中药资源保护与持续利用工程实验室，安徽六安237012；3.陆军军医大学士官学校，河北石家庄050051）

商陆（Phytolacca acinosa Roxb.）为商陆科植物商陆和垂序商陆的根，主产于河南、安徽、湖北等地。商陆味苦，性寒，有毒；归肺、脾、肾、大肠经，逐水消肿，通利二便，解毒散结，用于水肿胀满，二便不通，治痈肿疮毒[1]，为历版中国药典收载。现代药理研究表明，商陆富含多糖等化学成份[2-4]，具促进腹腔巨噬细胞吞噬功能，刺激小鼠脾淋巴细胞增殖及诱导脾细胞产生白介素-2、诱导小鼠腹腔巨噬细胞产生白介素-1、抗肿瘤等作用[5-11]。

响应面法（response surface methodology，RSM）是一种应用较广的试验优化方法，由于采用了更为合理的试验设计，能以最为经济的方式对试验进行全面研究，可高效快速地确定多因子系统中最佳因子组合。本试验利用响应面法从提取时间、提取温度、液料比三方面对商陆总多糖提取工艺进行优化，为商陆质量评价与资源开发利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

试验材料2016年11 月采自皖西学院药用植物园，品种经陈乃东教授鉴定为商陆（Phytolacca acinosa Roxb.）。新鲜的商陆根，洗净，-50 ℃冷冻干燥至恒重，粉碎，过40 目筛，备用。

蒽酮：上海科丰实业有限公司；硫酸、三氯甲烷：西陇科学股份有限公司；D（+）-葡萄糖：广州万从化工有限公司；正丁醇：天津博迪化工股份有限公司；无水乙醇：上海振兴化工一厂。以上均为国产分析纯。

电子天平（FA-1004 型号）：上海精科天平厂；立式高速冷冻离心器（HR/T20MN）：湖南赫西仪器装备有限公司；双束紫外可见分光光度计（TU-1901）：北京普析通用仪器有限责任公司；旋转蒸发器（RE-2000）：上海洪旋实验仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 商陆多糖的提取

精确称取商陆粉末约2 g，按设定液料比、提取温度、提取时间提取后过滤获总多糖提取液。

1.2.2 多糖含量的测定

1.2.2.1 标准曲线及以葡萄糖计多糖含量测定

精确配制0.1 mg/mL 的葡萄糖标准母液，精密量取 0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 于 7 支带塞刻度试管中，分别加双蒸水至体积为1.0 mL，摇匀，于冰水浴中缓慢滴加4.0 mL 0.2%蒽酮-硫酸溶液，摇匀，冷却后，100.0 ℃水浴中水浴10.0 min 后取出，冷却至20 ℃，以双蒸水为空白对照，于620 nm 下测吸光度值，得吸光度与浓度的回归方程a=8.256 7x+0.026 2，R2=0.990 1，在0～0.1 mg，吸光度（a）与浓度（x）呈良好的线性关系。

精密量取1.2.1 制备的总多糖提取液1.0 mL，按测定标准曲线相同的方法测吸光度，代入回归方程，计算出以葡萄糖计商陆多糖含量。

1.2.2.2 换算因子的测定及多糖含量的测定

将1.2.1 制备的总多糖提取液适当浓缩，经醇沉、反复Sevage 法脱蛋白[12-15]至无明显中层后，收集上部水层，-50 ℃冷冻干燥获精制多糖。

精密称取精制多糖10.0 mg，置100 mL 容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，精密吸取1.0 mL，按1.2.2.1 所述方法测定其吸光度，按下式计算换算因子（F）：

式中：W 为精制多糖质量，mg；C 为多糖液中葡萄糖折合浓度，mg/mL；D 为稀释因素。

本试验条件下测得F=1.762 8。

将1.2.2.1 测定的以葡萄糖计多糖含量乘以换算因子，获商陆多糖含量。

1.2.3 单因素试验

将不同提取条件下测得商陆多糖的含量作为商陆多糖提取率，分别考察提取温度、液料比、提取时间对多糖提取率的影响。试验方案如下：

保持液料比 50∶1（mL/g）、提取时间 3 h，研究提取温度 40、55、70、85、100 ℃对多糖提取的影响。

保持温度70 ℃、提取时间3 h，考察液料比10∶1、30∶1、50∶1、70∶1、90∶1（mL/g）对多糖提取的影响。

保持温度 70 ℃、液料比 50∶1（mL/g），考察提取时间为 1、2、3、4、5 h 对多糖提取的影响。

1.2.4 响应面试验

根据单因素试验结果，基于Box-Behnken 设计思路，运用Design-Expert 8.05b 软件，分别以A 液料比、B 提取温度、C 提取时间 3 个因素，以-1、0、1 表示其 3个水平（表1），多糖提取率为响应值，开展响应面法优化多糖提取工艺。

表1 响应面法试验因素与水平Table 1 Factors and levels used in response surface methodology

1.2.5 数据统计分析

以商陆多糖提取率为评价标准，采用Design-Expert 8.05b 软件分析测得的数据，确定商陆多糖的最佳提取工艺。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

单因素试验结果如图1 所示。

由图 1a 可见，当液料比为 10∶1（mL/g）～50∶1（mL/g）时，随着液料比增加，多糖的提取率迅速增加，当液料比超过70∶1（mL/g）时，多糖提取率增长缓慢。考虑液料比增加，后处理越费时、费力，从简化工业生产后处理角度出发，试验选择液料比 30∶1（mL/g）～70∶1（mL/g）作为进一步响应面法优化的液料比范围。

图1 液料比、提取温度与提取时间对多糖提取的影响Fig.1 The effects of liquid material ratio，extracting temperatures and extracting time on the yield of polysaccharide

从图1b 可见，提取温度对商陆多糖提取有明显影响，当温度由 40 ℃升为 55 ℃、85 ℃升为 100 ℃，提取率增长缓慢；当温度从55 ℃升至85 ℃，多糖的提取随温度的增高迅速上升，因此，试验选择提取温度55 ℃～85 ℃作为进一步响应面法优化的温度范围。

由图1c 可见，当提取时间由1 h 延长为2 h 时，多糖的提取率13.5%增加到14.1%，当提取时间由2 h 增加到4 h 时，多糖提取率由14.1%迅速增加到20.1%，4 h 后，随着时间延长，提取率增加缓慢，因此，试验选择提取时间2 h～4 h 作为进一步响应面法优化的提取时间范围。

2.2 Box-Behnken试验结果及数据分析

2.2.1 Box-Behnken 试验设计方案及结果

采取Box-Behnken 软件对单因素试验所得数据计量分析，最终得到最佳的试验结论。表2 为通过软件分析之后得到的对商陆多糖提取的三因素三水平试验设计及各试验条件下的商陆多糖提取率。

表2 响应面法优化试验设计及结果Table 2 Experimental design and result of response surface methodology

2.2.2 回归方程方差分析

依据表2 的结果，利用Design-Expert 8.0.5b 进行回归分析，得到商陆多糖提取率（Y）与料液比（A）、提取温度（B）、提取时间（C）多元非线性回归方程：

Y=-11.5+0.2A+0.2B+10.8C+0.002AB+0.05AC+0.03BC-0.004A2-0.003B2-2.4C2

对该模型进行显著性检验、方差分析，结果如表3所示。

表3 回归模型显著性检验结果Table 3 Significant test for regression model

续表3 回归模型显著性检验结果Continue table 3 Significant test for regression model

由表3 可见，该模型极显著（F 值=8.63，P＜0.01），且失拟项（P=0.024 3）不显著，说明该回归方程拟合度好，受其它因素影响较小，可以用来预测商陆多糖的最佳提取工艺。此外，液料比的一次项（A）与二次项（A2）、提取时间的二次项（C2）极显著（P＜0.01），提取温度的一次项（B）与二次项（B2）、提取时间的一次项（C）、液料比与提取温度的二次交互项（AB）、提取温度与提取时间的二次交互项（BC）均显著（P＜0.05），且各因素对响应值的影响不是简单的线性关系。由显著性检验中的决定系数R2=0.957 3，校正系数R2Adj=0.911 5可知，该模型中的预测值与实际值的相关性较高，并且能较好地反映出各个因素对商陆多糖提取率的影响。通过对上表的数学方差的统计和定量的分析，可以看出，各单因素对于多糖提取率的影响程度从大到小依次为液料比、提取时间、提取温度。

2.2.3 响应面图分析

通过响应面优化试验分析得到相应的响应面图，可以更加直观地反映出各单因素对多糖提取的影响结果以及各单因素之间交互影响的强弱关系。液料比、提取时间、提取温度这3 个因素两两交互作用的三维响应面与等高线图见图2。通过响应面图可知，在所对应的范围内存在极大值，即为各响应面的最高点，亦为等高线最内椭圆的中心点。

图2 两两因素交互作用对多糖提取的影响Fig.2 Interactive effects of three factors on extracting polysaccharide

从图2a 可知，液料比与提取时间对商陆多糖提取率的交互作用显著，当液料比为 60∶1（mL/g）、提取时间为3.5 h 时，多糖提取率最高，从等高线图亦可以看出，提取时间对响应值的影响更大。

从图2b 可知，液料比与提取温度对商陆多糖提取率的交互作用显著，多糖提取率在液料比60∶1（mL/g）、提取温度70 ℃时达到最高，等高线曲线斜率反映出提取温度对多糖提取率影响更明显。

从图2c 可知，提取温度与提取时间对商陆多糖提取率的交互作用显著，提取温度对多糖的影响占主导。在温度70 ℃、提取时间3.5 h 时，多糖提取率较高。

综合Design-expert 软件分析结果可以得出，商陆多糖最佳提取工艺为：液料比 60∶1（mL/g）、温度 70 ℃提取3.5 h 时，理论上此条件下多糖提取率为21.38%。

2.2.4 验证试验

为了对最优提取工艺进行验证，在液料比60∶1（mL/g）、提取温度70 ℃、提取时间3.5 h 下进行3 组平行重复试验，最终得到的商陆多糖的提取率为21.65%，与预测值的相差为1.26%，差异较小。故利用响应面优化提商陆多糖得到的提取工艺真实可靠，明显高于鲁建江等采用微波提取测定的19.061%[16]，具有一定的实际应用价值。

3 结论

本研究通过响应面优化法，对液料比、提取时间、提取温度这3 个因素进行考察，并采用Design-Expert 8.0.6 软件进行分析，结果得出，液料比、提取时间与提取温度对多糖提取率影响显著，其影响顺序为：液料比＞提取时间＞提取温度。通过二次回归方程，得到的最优提取工艺为液料比 60∶1（mL/g）、提取时间 3.5 h、提取温度70 ℃，商陆多糖的实际平均提取率为21.65%。