β-葡萄糖苷酶非水相生物合成红景天苷

张 乐，沙久凯，陈宇彤，闫凯迪，王 华

(南京理工大学泰州科技学院 药学院，江苏 泰州 225300)

红景天为景天科红景天属植物。我国应用红景天很早，在藏医《四部医典》和《本草纲目》均有记载，红景天是一种同人参等重要中药材相媲美的高价值保健药源，可入药，也可做保健品[1]。近年来研究证明红景天中主要有效成分红景天苷具有抗疲劳、抗衰老、免疫调节、清除自由基等多种药理作用。

目前主要从植物体中提取获得红景天苷，但是植物体中的含量很低，虽然苏波等[2]对红景天苷提取工艺进行了优化，收率并不高，故人们开始探寻新方法以高效合成红景天苷。另外还有利用化学方法合成和愈伤组织培养合成[3]。化学方法合成是以葡萄糖为主要原料合成、以对羟基苯甲醛或对羟基苯乙酸为主要原料合成、以对氨基苯乙醇或对羟基苯乙醇为主要原料合成。化学合成法具有收率和纯度都很高、反应快速、成本低等优点，但大多合成路线需要对基团进行选择性保护或使用昂贵的金属催化剂，所用的一些催化剂和试剂易污染环境，而且其立体选择性差。愈伤组织培养合成是以红景天茎、叶及种子萌发的子叶等为外植体诱导而成的愈伤组织进而合成红景天苷。酶法合成红景天苷因具有选择性高、产物纯度较高、便于分离纯化等优点而备受关注[4]。

本文在非水相介质中以β-葡萄糖苷酶催化逆水解反应合成红景天苷，为高效制备红景天苷提供新思路。

1 材料

1.1 试剂

β-葡萄糖苷酶，上海金穗生物科技有限公司；红景天苷对照品(≥98% HPLC)，合肥博美生物科技有限责任公司；其余试剂均为市售分析纯。

1.2 仪器

HH-W0-5L智控升降油浴；SHZ-DⅢ循环水式多用真空泵；WT10002K电子分析天平；SHA-B恒温振荡器；80-2台式电动离心机；RE52C旋转蒸发器；UV-2450紫外分光光度计。

2 实验方法

2.1 酶促合成反应步骤

在25 mL具塞锥形瓶中，取酪醇、D-葡萄糖混溶于10 mL乙腈/缓冲液(pH值=4.5的醋酸-醋酸钠缓冲液：醋酸钠18 g，冰醋酸9.8 mL，加水稀释至1000 mL)，加入50 mg的β-葡萄糖苷酶粉，于40℃恒温震荡反应48 h。取反应液，用80-2台式电动离心机离心20 min(转速2000 r/min)，除去残渣，得澄清溶液，向其中加入正丁醇约20 mL进行多次萃取，合并萃取液，旋蒸，得浓缩液，测定浓缩液体积，并通过分光光度法检测其吸光度。

2.2 红景天苷含量的测定

根据董彦莉等[5]对红景天中所含红景天苷含量测定方法的研究中选择紫外分光光度法，选定的检测波长为230 nm。以吸光值为纵坐标，以红景天苷浓度为横坐标，作红景天苷标准曲线(见图1)。

图1 红景天苷的紫外吸光度标准曲线Fig.1 Standard curve of ultraviolet absorbance of salidroside

3 催化条件的优化

3.1 单因素实验

3.1.1 酪醇浓度对红景天苷合成的影响

在葡萄糖的浓度为2.5%，40℃，80%乙腈反应体系中，摇床酶促反应48 h，研究酪醇浓度分别为2%、4%、6%、8%、10%、12%时，对红景天苷合成的影响，见图2。

图2 酪醇浓度对红景天苷合成的影响Fig.2 Effect of tyrosol concentration on salidroside synthesis

从图2可以看出，在其他条件不变的情况下，随着酪醇浓度的不断增加，红景天苷的转化率也不断增加，当酪醇起始浓度为8%时，红景天苷的转化率最大，而后又开始下降。分析可知，底物浓度过大，在一定条件下抑制了β-葡萄糖苷酶的催化活性，使酶活下降，从而使红景天苷产率降低。

3.1.2 葡萄糖浓度对红景天苷合成的影响

在酪醇的浓度为8%，40℃，80%乙腈反应体系中，摇床酶促反应48 h，研究葡萄糖浓度分别为1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%时，对红景天苷合成的影响，见图3。

图3 葡萄糖浓度对红景天苷合成的影响Fig.3 Effect of slucose concentration on salidroside synthesis

从图3可以看出，在其它条件不变的条件下，红景天苷的转化率随当葡萄糖浓度先增加后又降低，在葡糖糖浓度为2.5%时取得最大值。分析可知，这可能是因为葡萄糖浓度过高，在80%乙腈反应体系中未完全溶解，另外还有底物抑制效应，使得红景天苷转化率降低。

3.1.3 反应时间对红景天苷合成的影响

图4 反应时间对红景天苷合成的影响Fig.4 Effect of reaction time on salidroside synthesis

在葡萄糖浓度为2.5%，酪醇的浓度为8%，40℃，80%乙腈反应体系中，摇床酶促反应48 h，研究反应时间分别为12、24、48、72、96、120 h时，对红景天苷合成的影响，见图4。

从图4可以看出，在其它条件不变的条件下，在12～72 h内红景天苷的转化率率随着时间的延长而增加，到达72 h时红景天苷的转化率率达到最大值。但是当时间超过72 h后，红景天苷的转化率率有所下降。分析可知，可能是由于时间的延长，红景天苷提取液中的其他无效成分的溶出，从而影响了有效成分之红景天苷的释放，同时，β-葡萄糖苷酶在有机溶剂中时间过长导致酶活性降低从而使转化率降低[6]。

3.1.4 乙腈浓度对红景天苷合成的影响

在葡萄糖的浓度为2.5%，酪醇浓度为8%，40℃，摇床酶促反应48 h，研究乙腈浓度分别为40%、50%、60%、70%、80%、90%时，对红景天苷合成的影响，见图5。

图5 乙腈浓度对红景天苷合成的影响Fig.5 Effect of acetonitrile concentration on synthesis of salidroside

从图5可以看出，在其它条件不变的条件下，随着乙腈浓度增加，转化率增加，直至乙腈浓度达到80%，转化率最高，接着开始降低。分析可知，因为水分过多，产物极易发生水解反应[7]，所以红景天苷的转化率较低，而在适当浓度的有机溶剂中，水解反应会受到一定的抑制，所以转化率较高。

3.2 正交试验

根据单因素实验结果，针对酪醇浓度、葡萄糖浓度、乙腈浓度、反应时间四个因素，确定如表1的L9(43)的正交试验。

表1 正交实验因素水平表Table 1 Table of factors and levels for orthogonal test

实验结果如表2所示。

表2 正交实验结果Table 2 Results of orthogonal test

表2(续)

从表2对红景天苷转化率的极差分析来看，四个因素对红景天苷转化率影响水平的强弱为A>B>C>D，即转化率的最大影响因素为葡萄糖浓度，最小的影响因素是反应时间；最佳水平组合为A1B2C2D2，即实验2，转化率最高，为16.98%。

3.3 验证实验

为了进一步确认最佳优化组合A1B2C2D2是否能够达到预期目标，对其进行验证性试验，此时，红景天苷的转化率分别为16.34%、15.93%、17.01%，平均转化率为16.43%，该结果显示红景天苷的转化率较高且较稳定。通过该验证试验可以进一步的说明该种提取工艺可以达到预期的目标。

4 结论

本文在单因素试验的基础上，应用正交试验研究了各单因素之间的相互影响，优化了合成红景天苷的工艺，并确定了最佳的工艺参数：酪醇浓度8%，葡萄糖浓度2.5%，乙腈浓度为80%，40℃下反应72 h，此时红景天苷的转化率为16.43%。与Hiroyuki Akita等[8]提取的β-葡萄糖苷酶催化合成红景天苷的产量相比，其产率为11%，本文优化的工艺条件下，酶法合成红景天苷的产率得到了较大幅度的提高，可促进实现绿色、高效制备红景天苷的目标。