2015-2017年营口市诺如病毒腹泻病例检测结果分析

李蕙　单芙蓉　安静　孙晓岩　郭素英

【摘要】 目的：了解2015-2017年营口市腹泻患者中诺如病毒的感染情况和流行趋势。方法：收集2015-2017年每年的5-10月份营口市54家食源性疾病哨点医院腹泻患者的粪便标本363份，采用实时荧光PCR方法进行核酸检测。结果：共检出阳性标本29份，阳性率为7.99%;检出GⅠ型诺如病毒4份，检出率为1.10%，GⅡ型诺如病毒28份，检出率为7.71%;不同性别、年龄患者的阳性率比较，差异均无统计学意义（P>0.05）;可疑原因食品中，粮食类及其制品的病例阳性率最高（11.11%），其次是果蔬及其制品（10.61%）、肉与肉制品（10.53%）、水产品动物及其制品（8.85%）、混合食品（5.71%），乳制品阳性率最低（5.00%）。结论：营口市食源性疾病中存在诺如病毒的感染，以GⅡ型为主，3年检测提示诺如病毒已成为营口病毒性腹泻的病原之一，相关部门应及早应对，加强监测，以减少疾病的暴发与流行。

【关键词】 诺如病毒; 腹泻; 实时荧光PCR

Analysis on the Results of Detection of Norovirus in Diarrhea Case in Yingkou City From 2015 to 2017/LI Hui，SHAN Furong，AN Jing，et al.//Medical Innovation of China，2019，16（20）：-153

【Abstract】 Objective：To understand the infection and epidemic trend of norovirus in patients with diarrhea in Yingkou City from 2015 to 2017.Method：A total of 363 stool specimens of patients with diarrhea in 54 cases of food-borne disease sentinel hospital in Yingkou City on May to October from 2015 to 2017 were collected，and real-time fluorescent PCR was used for nucleic acid detection.Result：A total of 29 positive specimens were detected，with a positive rate of 7.99%，4 samples of norovirus GⅠ were detected，the detection rate was 1.10%，and 28 samples of norovirus GⅡ were detected，the detection rate was 7.71%.There were no significant differences in the positive rate between patients of different sex and age（P>0.05）.Among the foods with suspected causes，food and its products had the highest positive rate（11.11%），followed by fruits and vegetables and their products（10.61%），meat and meat products（10.53%），aquatic animals and their products（8.85%），mixed foods（5.71%）and dairy products（5.00%）.Conclusion：Noirovirus infection exists in food-borne diseases in Yingkou City，mainly type GⅡ，3-year detection indicates that noirovirus has become one of the pathogens of viral diarrhea in Yingkou City，relevant departments should deal with it as early as possible and strengthen surveillance in order to reduce the outbreak and epidemic of the disease.

【Key words】 Norovirus; Diarrhea; Real-time fluorescence PCR

First-authors address：Yingkou Affair Center for Health and Wellness，Yingkou 115004，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.20.039

諾如病毒是全球非细菌性胃肠炎的主要病原体，可以通过污染的食物、水或环境直接或间接地在人与人之间传播，属于杯状病毒科（Caliciviridae），基因组大小约为7.5 kb，包括3个开放阅读框（ORF）。诺如病毒被分类为至少6种基因组，即GⅠ～GⅥ[1]。根据ORF2全基因序列，GⅠ可分为14个基因型，GⅡ可分为17个基因型[2]。GⅠ、GⅡ、GⅣ型可感染人，其中GⅠ和GⅡ型是感染人的主要遗传组，根据核苷酸的变异程度可进一步细分为不同基因型[3]。诺如病毒具有很强的传染性，极易引起暴发流行[4]。诺如病毒具有感染剂量低、稳定性强、多样性大、基因突变频繁等特点。除了这些特征外，诺如病毒还易在医院、酒店和学校等封闭环境中快速广泛地传播[5]。为了解营口市感染性腹泻病例中的诺如病毒感染状况，目前，营口市共有

54家食源性疾病哨点医院。本研究通过首次收集营口市2015-2017年每年的5-10月共363份急性胃肠炎腹泻患者粪便标本，了解诺如病毒感染的变化趋势，为营口市诺如病毒的预防控制提供科学依据。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2015-2017年按照营口市食源性疾病诺如病毒监测方案要求，采集54家营口市食源性疾病哨点医院急性胃肠炎腹泻患者的粪便标本。每年5-10月共收集粪便标本363份（10～15 g/份）。

1.2 试剂与仪器 RNeasy Mini Kit病毒核酸提取试剂盒（美国QIAGEN公司）。全自动核酸提取仪QIACube（美国QIAGEN公司）。诺如病毒GⅠ型/GⅡ型核酸检测试剂盒（荧光PCR法）（JC50103，江苏硕世生物科技有限公司）。QuantStudio 5实时荧光定量PCR仪（美国ABI公司）。

1.3 方法 （1）病毒的RNA提取：在生物安全柜中挑取黄豆大小的粪便（水样便50～100 μL）置于已标记的1.5 mL EP管中，加入500 μL生理盐水溶解稀释。震荡15 s，10 000 r/min 4 ℃离心5 min。取200 μL上清液用RNeasy Mini Kit（JC50103）提取核酸。按照试剂盒说明书进行操作。提取的核酸置-40 ℃待用或立即扩增。（2）实时荧光RT-PCR扩增反应体系及条件：将提取好的核酸标本进行诺如病毒GⅠ型和GⅡ型Real-time PCR检测。每份标本扩增反应体系：RT-PCR反应液7.5 μL，酶混合液5 μL，诺如病毒GⅠ型/GⅡ型反应液7.5 μL，

待测标本5 μL，总反应体积25 μL。待测标本和阴性、阳性对照同时按照下列循环参数进行扩增检测：50 ℃ 30 min，95 ℃ 5 min;95 ℃ 10 s，55 ℃40 s，

45个循环;55 ℃时荧光检测，检测通道为FAM。

1.4 结果判定 按照说明书上的结果判断标准判断结果。

1.5 统计学处理 使用SPSS 20.0软件对所得数据进行统计分析，计数资料以率（%）表示，比较采用字2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 诺如病毒的检出情况 2015-2017年每年的5-10月份共收集标本363份，其中2015年122份，2016年120份，2017年121份，共检出阳性标本29份，阳性率为7.99%。检出GⅠ型诺如病毒4份，检出率为1.10%，GⅡ型诺如病毒28份，检出率为7.71%，有3例患者同时感染了GⅠ和GⅡ型诺如病毒，见表1。

2.2 人群特征 男性标本194份，女性标本169份，男女比例1.15︰1。检出男性诺如病毒阳性14份（7.22%），女性诺如病毒阳性15份（8.88%）;感染诺如病毒患者中年龄≥70岁阳性率最高（11.11%），其次是0～29岁（8.57%），中年人群的阳性率相对较低;不同性别、年龄患者的阳性率比较，差异均无统计学意义（P>0.05），見表2。

2.3 可疑食品诺如病毒的检测 粮食类及其制品的病例阳性率最高（11.11%），其次是果蔬及其制品（10.61%）、肉与肉制品（10.53%）、水产品动物及其制品（8.85%）、混合食品（5.71%），乳制品的病例阳性率最低（5.00%），见表3。

3 讨论

诺如病毒虽属自限性疾病，但仍可导致儿童、老年人和免疫力低下患者的致病甚至死亡[6]。其主要传播途径有：受污染的食物和水等、低剂量感染（<10个拷贝）[7]。营口市哨点医院腹泻患者中诺如病毒检测的结果显示：2015-2017年每年的5-10月份共收集标本363份，其中2015年122份，2016年120份，2017年121份，共检出阳性标本29份，阳性率为7.99%，每年的食源性腹泻病例中均有诺如病毒的检出，每年的检出率较为平稳，没有出现显著的上升或下降趋势。这可能是由于收集标本的数量存在不足，部分腹泻症状较轻或以呕吐为主要临床表现的病例，存在不就诊或者未进入监测系统的情况，并且采样时间为5-10月份，冬天季节的样本没有覆盖。据了解，诺如病毒全年均可发生感染，并且其喜冷怕热，冬季正是诺如病毒感染的高发季节。提示相关部门在今后的监测中应加强冬季诺如病毒的检测。本研究中患者的主要症状为恶心呕吐，腹痛腹泻水样便，有的甚至出现发热，面色苍白等较为严重的症状，患者中以GⅡ型诺如病毒感染为主，有3例患者同时感染了GⅠ和GⅡ型诺如病毒;不同性别、年龄患者的阳性率比较，差异均无统计学意义（P>0.05），提示诺如病毒是人群对诺如病毒普遍易感。由于诸多原因，本研究缺少5岁以下儿童感染的数据。研究表明，婴幼儿为诺如病毒易感人群，部分研究显示老人与儿童最容易感染诺如病毒，但有学者认为年龄与诺如病毒易感性无关[8]。本研究结果显示，粮食类及其制品的病例阳性率最高（11.11%），其次是果蔬及其制品（10.61%）、肉与肉制品（10.53%）、水产品动物及其制品（8.85%）、混合食品（5.71%），乳制品的病例阳性率最低（5.00%）。本研究所涉及的食品种类多种多样，粮食和果蔬等农产品很容易在加工之前被灌溉水或有机肥料中的诺如病毒污染，如葡萄等通常被认为是诺如病毒暴发的载体[9]，而贝类食品更是其生存的温床，因此加强食品卫生安全是人们健康生活的重要保障。

核酸检测方法是目前诺如病毒检测的重要手段之一，具有灵敏、特异、快速等优点。近年来，我国对于诺如病毒的分子生物学检测和分型分析方面也有快速进展。白颉等[10]应用实时荧光PCR手段对东海海域的贝类食品进行了诺如病毒检测，发现除太平洋牡蛎、毛蚶外，在僧帽牡蛎和杂色蛤中也存在诺如病毒。文献[11]结果显示，在20.7%的样本中检测到诺如病毒，同源基因组Ⅱ占优势，并且不同样本诺如病毒水平差异很大。湖州地区首次报道了应用直接测序法对诺如病毒GⅡ.17几乎完整基因组测序序列，这对于研究病毒的遗传进化，快速诊断试剂的开发和疫苗的设计发挥重要作用[12]。目前，随着诺如病毒变异株的出现，世界各地对于其基因型的研究越来越多。在2016-2017冬季，一种罕见的重组诺如病毒基因型GⅡ.P16-GⅡ.2在亚洲部分地区急剧增加[13]。香港从2016年8月开始检测住院病例患者的诺如病毒GⅡ.P16-GⅡ.2感染情况[14]。在中国湖州，GⅡ.P16-GⅡ.2菌株在腹泻病例中也有发现，并且该菌株的VP1氨基酸序列在HBGA结合位点的氨基酸和预测的表位中未发现常见突变[15]。

尽管本研究存在些许不足，但本研究首次对营口市诺如病毒流行趋势简单的分析，对今后的研究方向具有一定的指示及指导作用。目前，营口市对诺如病毒的监测工作尚处于起步阶段，在今后的工作中着重加深对其基因型的分布与流行病学的分析，及时了解新型GⅡ型变异株或其他重组株出现的机制和来源，预测其流行趋势。

参考文献

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