小麦遗传改良中的重要基因源

韩冉 刁瑞宁 梁海凡 訾妍 汪晓璐

摘要：通过远缘杂交创制育种新材料并应用于小麦新品种培育，对拓宽小麦的遗传基础和提高育种水平具有重要意义。冰草属（Agropyron）物种具有较强的抗旱、抗寒、耐盐和抗病特性，是小麦遗传改良的重要基因源。本研究对小麦与冰草杂交、小麦-冰草异染色体系的创制、小麦背景中冰草染色质的鉴定和冰草有益性状向小麦导入等方面的研究进展进行总结，以期为更好地开发利用该属物种提供依据。

关键词：小麦;冰草;远缘杂交;染色体系

中图分类号：S512.103.51+S543+.903.51  文献标识号：A  文章编号：1001-4942（2019）08-0001-09

Abstract It is of great significance to broaden genetic base of wheat and improve breeding level through intergeneric hybridization. Agropyron cristatum is an important genetic source for wheat genetic improvement with strong resistance to drought， cold， salt and diseases. In the study， crossing wheat with Agropyron cristatum， creation of alien chromosome lines， chromatin identification of Agropyron cristatum in wheat and introduction of beneficial characters of Agropyron cristatum into wheat were summarized to provide base for better exploitation and utilization of Agropyron cristatum.

Keywords Wheat; Agropyron cristatum; Distant hybridization; Chromosome lines

小麦（Triticum aestivum L.，2n=6x=42，AABBDD）是世界上最重要的粮食作物之一，主要种植在干旱和半干旱地区，占世界作物种植面积的1/5，是世界上40%人口的主要食粮[1]。然而，长期品种间杂交及对少数骨干亲本的大量应用，容易造成品种抗源日趋单一化和遗传变异范围缩小[2]，很难应对新的致病生理小种的产生与流行[3， 4]。同时，气候异常变化，花期低温倒春寒、灌浆后期高温逼熟等带来的减产威胁着小麦的生产安全。因此，生物和非生物胁迫、狭窄的遗传基础等成為影响小麦遗传改良的主要问题。小麦野生近缘植物遗传多样性丰富，携带抗病、抗逆和丰产等有益基因[5， 6]，通过远缘杂交将其优异基因导入小麦，是解决小麦抗源单一和遗传基础狭窄问题的有效途径。

冰草属（Agropyron）物种具有抗病、抗逆、蛋白含量高和多花多实等特点[5-7]，是小麦遗传改良的重要基因源。该属物种基本基因组为P，有二倍体、四倍体和六倍体之分[8]。二倍体种包括扁穗冰草（A. cristatum）、西伯利亚冰草（A. fragile）、沙芦草或蒙古冰草（A. mongolicum）和丛生冰草（A. caespitosum）等[9-11]。四倍体种包括扁穗冰草（A. cristatum）、沙生冰草（A. desertorum）、西伯利亚冰草（A. fragile）、根茎冰草（A. michnoi）和粗茎冰草（A. trachyaulum）等[10-12]。六倍体种有扁穗冰草（A. cristatum）等[10， 11]。

本文综述了小麦与冰草的远缘杂交概况、小麦-冰草异染色体系的创制、小麦背景中冰草染色质的鉴定和冰草有益性状向小麦导入等方面的研究进展，以期为更好地利用冰草优异基因改良小麦提供理论依据。

1 小麦-冰草远缘杂交概况

在20世纪90年代前后，许多学者开展了普通小麦与冰草属植物的属间杂交工作，获得了可育的自交和回交后代[7，13-16]。

Limin和Fowler[14]分别将扁穗冰草（2n=14）和沙生冰草（2n=28）与普通小麦（2n=42）杂交，利用秋水仙碱对小麦-冰草杂交种进行处理，成功获得了小麦-冰草双二倍体（2n=8x=56，AABBDDPP）。Jauhar等[17]为了将冰草的抗旱、抗寒特性转移到普通小麦中，将冰草与小麦进行了属间杂交，结果发现，F1杂种与小麦亲本相似，形态几乎介于双亲之间，并对其染色体配对情况进行了研究。Soliman等[18]将四倍体小麦（T. turgidum，2n=4x=28，AABB）与节节麦（T. tauschii，2n=2x =14，DD）-冰草双二倍体（DDPP）杂交，获得了具有多年生特性的小麦-冰草双二倍体（AABBDDPP）。

Chen等[13]获得普通小麦中国春与四倍体冰草的杂种F1植株，认为冰草P染色体组中存在抑制Ph基因作用的基因，并利用中国春对杂种F1进行回交，获得了BC1种子，进而采用胚拯救技术获得5个染色体为39～41条的小麦-冰草BC1植株，但是所有的植株都是自交不育的[19]，后续再未见相关的研究报道。

李立会等[20]首次报道将沙生冰草与中国春杂交，获得了杂种F1，并获得自交以及回交后代，证实小麦与冰草的可杂交性。李立会[21]又通过幼胚培养获得了普通小麦与沙生冰草属间杂种，发现小麦-沙生冰草杂交种的穗部特征与普通小麦相似，表现为长芒，且F1杂交种自育性较好，利用六倍体和四倍体小麦对F1植株进行回交很容易获得种子。此外，Li和Dong[15]发现，小麦与根茎冰草以及小麦与沙生冰草的杂种F1中均出现了较高频率的二价体（>10），并且F1自交或利用小麦进行回交均得到了可育的种子[22]。然而，在小麦与四倍体冰草的F1中，二价体出现的频率（≈5个）远低于期望值（7个），F1植株没有得到种子，但从幼穗培养的再生植株均得到了自交和回交种子[7]。沙芦草与小麦的杂交，未见有成功的报道[23]。

2 小麦-冰草异染色体系的创制和研究现状

小麦异附加系是利用染色体工程方法将小麦近缘属的染色体转移到小麦遗传背景中而培育出的一种非整倍体材料，根据所附加染色体的数目，可将其分为单体、二体和多重异附加系[24-26]。二体附加系是这些异附加系中研究和利用价值最高的一种，是创制异代换系和易位系的重要桥梁材料，是探讨小麦与其近缘植物的亲缘关系、进行基因定位等遗传研究的基础材料，在理论研究和育种实践中都具有十分重要的价值[27， 28]。

在小麦-冰草异源附加系创制方面，Chen等[29]采用非放射性地高辛标记的来自小麦每一条染色体臂上的特异探针各2个，通过Southern成功地鉴定了54株小麦品种中国春-冰草P基因组单体附加系，发现冰草染色体1P、2P、3P、4P、5P、6P以及冰草染色体臂2PS、2PL、5PL、6PS和6PL已经分别添加到小麦基因组中。李立会等[22， 30]对来自普通小麦品种Fukuho×冰草Z559杂种的F3、F2BC1、BC4和BC3F1世代的222株进行减数分裂行为观察，结果发现，2n染色体的分布范围为39～54;其中有5个材料可能是小麦-冰草异源附加系，并对其杂交组合所衍生的BC2到BC5世代的866个单株进行分析和外源染色质检测，获得了11个在表型性状上有明显差异的小麦-冰草异源二体附加系。Wu等[31]利用基因组原位杂交（GISH）、荧光原位杂交（FISH）、醇溶蛋白、表达序列标签-简单重复序列（EST-SSR）和SSR分析，鉴定出含有大穗多花多粒优异基因的小麦-冰草6P二体附加系4844-12。Han等[32]对6个普通小麦-冰草二体附加系进行表型鉴定、GISH及分子标记分析，通过比较作图发现6个附加系中的冰草染色体均属于染色体第六同源群，并将其中的冰草6P染色体分为四种类型，即6PⅠ、6PⅡ、6PⅢ和6PⅣ，发现与小麦染色体相比，冰草6P染色体在不同的附加系中均发生了明显的染色体结构重排，其中含6PⅠ型染色体的附加系携带抗白粉病基因，具有多穗粒数等特点，是小麦的优异基因源。Li等[33]利用GISH方法从小麦-冰草杂交种质中鉴定出了小麦-冰草2P染色体二体附加系Ⅱ-9-3，并用冰草2P染色体特异性STS标记对小麦染色体与冰草2P染色体进行同源性分析。Li等[34]用GISH和特异性位点扩增片段测序（SLAF-seq）法对小麦-冰草衍生株系5113进行鉴定，发现该株系是一个新的小麦-冰草二体6P附加系。Chen等[35]利用根尖细胞染色体条数检测、GISH、花粉母细胞调查、SSR标记、表达序列标签-序列标签位点（EST-STS）标记结合FISH技术对小麦-冰草衍生材料Ⅱ-13和Ⅱ-23进行鉴定和分析，通过回交得到了6个小麦-冰草二体附加系和5个代换系。小麦-冰草异源附加系材料及其染色体组成见表1。

创制含有目标性状基因的易位系是冰草优异基因应用到小麦生产上的主要形式，创制方法包括自发产生、杀配子诱导、Ph缺失诱导和辐射诱导等[27， 28， 37-39]。王睿辉等[27]利用细胞遗传学方法对20个小麦-冰草二体附加系开放授粉后代的染色体数目进行分析，从中检测到1个小麦-冰草代换系5111-1和1个小麦-冰草易位系5112-4。王敬昌[40]利用中国春-柱穗山羊草2C二体附加系与小麦-冰草二体附加系杂交，获得大量含有冰草优异性状基因的易位系。王晓光等[41]为了将冰草的多粒基因转入小麦，以具有多粒特性的小麦-冰草二体附加系4844-12为材料与小麦品种藁城8901杂交，对其杂种F1进行60Co-γ辐照处理;用冰草P基因组特异SSR和序列特异性扩增（SCAR）标记对M2 236个单株进行鉴定，进而对部分含P染色质阳性植株进行GISH检测，发现其中有3株为小麦-冰草异源易位（渐渗）系。杨国辉等[39]对小麦-冰草附加系Ⅱ-21-2进行细胞遗传学和Ph1基因扩增等分析与检测，发现附加系Ⅱ-21-2的1·4重组P染色体能够抑制小麦Ph基因的作用，从而引起小麦部分同源染色体之间的联会，并造成包括小麦3B-3D等部分同源染色体之间的易位。Liu等[37]将小麦-圆柱山羊草杀配子染色体2C附加系与含有重组染色体（1·4）P的小麦-冰草二体附加系Ⅱ-21杂交，通过分子标记和GISH对杂交后代进行检测，在3个小麦-冰草外源易位系中鉴定出6种易位类型，包括（1·4）P染色体整臂易位和端部易位，此外，从这批材料中还鉴定出了12个含有冰草（1·4）P染色体的附加-删除系。Luan等[38]以小麦-冰草异源二体附加系和代换系为桥梁材料，通过杀配子染色体和辐射诱导了小麦-冰草6P易位系的产生，GISH结果显示，冰草6P染色体可易位至小麦ABD基因组，重组频率为A基因组> B基因组> D基因组;冰草6P染色体易位至小麦染色体第1、2、3、5和6同源群，包括类型丰富的易位系，比如全臂易位、末端易位、节段易位和间位易位等。Song等[28]利用Co-γ射线诱变小麦-冰草二体附加系获得小麦-冰草易位系。Ochoa等[42]利用自育的小麦-扁穗冰草双二倍体与普通小麦进行杂交和回交，从其后代中选育出了一个具有42条染色体的可育稳定株系（命名为TH4），GISH和FISH分析发现，TH4携带一个补偿性小麦-冰草罗伯逊易位（易位发生在小麦染色体1B长臂和一个同源群鉴定的冰草染色体短臂之间）。Zhang等[43]用GISH、双色FISH和分子標记对来源于小麦-冰草6P染色体附加系的辐射诱导后代普冰3035进行鉴定和分析，结果发现，普冰3035是一个Ti1AS-6PL-1AS·1AL中间易位。黄琛等[44]利用细胞学手段对小麦-冰草二体代换系4844-8、二体附加系4844-12与普通小麦杂交后进行辐照，利用GISH技术从其后代材料中鉴定出2个具有冰草染色体小片段的纯合中间插入易位系。Li等[45]利用60Co-γ辐照小麦-冰草2P染色体二体附加系Ⅱ-9-3，同时利用杀配子染色体2C对其进行诱导，然后用GISH和双色FISH对其后代材料进行鉴定，获得了49个小麦-冰草易位系，其中包括整臂易位、染色体片段易位和中间易位等多种易位类型;FISH检测结果显示，冰草2P染色体片段可易位到小麦1A、2A、3A、4A、5A、6A、7A、3B、5B、7B、1D、4D和6D等不同染色体上。Lu等[46]利用60Co-γ射线对小麦-冰草7P二体附加系Ⅱ-5-1进行辐射处理，利用GISH和FISH对其后代材料进行筛选检测，从中鉴定出18个小麦-冰草染色体易位系和3个小麦-冰草染色体删除系，涉及的小麦易位染色体包括2A、3A、5A、7A、3B、5B、7B、3D和7D。

Zhang等[47]利用GISH、双色FISH和分子标记技术检测了小麦背景中的冰草6P染色体小片段及其易位断点位置，发现普冰2978是一个T1AS-6PL-1AS·1AL中间插入易位，共有42条染色体，该断点位于小麦1AS染色体的着丝粒区附近。Zhang等[48]利用细胞遗传学和分子生物学的方法对小麦-冰草6P衍生系进行鉴定，结果发现，普冰260是一个T3BL.3BS-6PL易位系，并且染色体断裂位点发生在3BS9-0.57-0.75片段长度内。孙洋洋等[49]从小麦-冰草衍生系Ⅱ-23的回交后代中分离鉴定出1个自发易位系7-20，GISH鉴定表明7-20是一个整臂易位系;经非变性荧光原位杂交（ND-FISH）检测发现，小麦的7A染色体发生易位;进一步利用小麦7A染色体特异SSR标记以及冰草7P染色体特异STS标记对7-20易位系中的外源易位片段大小以及易位染色体的组成进行鉴定，确定7-20为T7PL·7AL罗伯逊易位系。

3 小麦背景中冰草染色体的鉴定

在外源基因转移过程中，对导入的外源染色体进行检测是小麦染色体工程研究的重要内容。对外源染色体追踪鉴定的准确性，直接影响到新种质选育的准确性与效率，进而影响利用外源有益基因改良小麦的进程。在外源染色体导入、追踪和鉴定过程中，遗传标记起着至关重要的作用。开发冰草染色体特异分子标记对于加快冰草优异基因向小麦转移和应用具有重大意义，因此许多学者利用同工酶标记、细胞遗传学标记和分子标记对小麦背景中的冰草染色体进行鉴定[31， 37， 50-52]。

Chen等[29]首次利用限制性片段长度多态性（RFLP）技术鉴定了中国春小麦-冰草单体附加系和易位系中外源染色体与小麦染色体部分同源关系。之后又有学者利用随机扩增多态性DNA（RAPD）标记，筛选出冰草P基因组特异的分子标记OPC04、OPP12、OPX07-1036、OPX11-817和OPC05-1539[50， 53];之后Wu等[53]又将RAPD标记转化为SCAR标记，方便用于小麦P基因组染色质的检测。Liu等[37]和Luan等[38]开发了小麦-冰草的SCAR标记SCX7960和SC5815。Zhang等[54]开发了9个冰草P基因组特异的SLAF标记，鉴定小麦-冰草易位系普冰3035的染色体组成。之后Li等[33， 34]用开发的SLAF标记[54， 55]鉴定小麦-冰草二体2P和6P附加系。宿俊吉等[51]利用小麦第七同源群上534对SSRs引物和351对EST-SSRs引物，初步扩增了具有代表性的普通小麦品种Fukuho和一个四倍体附加系以及冰草Z559的基因组DNA，结果发现，在Fukuho基因组DNA上分别检测到475对（89.0%）SSRs引物和314对（89.5%）EST-SSRs引物扩增的条带，而在Z559的基因组DNA上检测到226对（42.3%）SSRs和258对（73.5%）EST-SSRs引物扩增的条带，可见，EST-SSRs要比SSRs对冰草具有更高的转移能力。Luan等[38]和Lu等[56]利用开发的7个冰草6P和55个冰草7P的STS标记，鉴定了小麦-冰草附加系、易位系和删除系。代程等[57]利用冰草转录组测序获得的EST序列设计的P基因组EST分子标记引物，筛选在普通小麦背景下的6P染色体特异分子标记，结果从1 453对P基因组EST引物中筛选出130对小麦-冰草6P附加系特异标记引物;进而将这些特异标记与NCBI nr蛋白质数据库及小麦EST序列进行比对，发现4条冰草EST序列的功能注释与抗病、抗逆相关，36条冰草EST与已经定位的小麦EST具有较高的相似性，其中33条（91.67%）位于小麦第6部分同源群染色体。Han等[32]用563个小麦多态性SSR和EST-SSR标记[58]从小麦-冰草二体附加系中鉴定出51个P基因组特异SSR和EST-SSR标记（Wmc716、Xgwm268、Swes215等）。Zhang等[54]通过冰草的转录组测序，开发了冰草的特异EST-STS引物，并利用这些标记对小麦-冰草附加系、易位系和删除系的基因组组成及抗病性进行研究[35，59-62]。Said等[52]对冰草基因组DNA进行测序并对新的串联重复序列进行发掘，进而利用FISH对除5S和45S核糖体DNA外的5个重复序列和黑麦亚端粒重复序列pSc119.2和pSc200在冰草染色体上的分布情况进行研究，鉴定出四个新的串联重复序列（ACRI_CL78、ACRI_CL80、ACRI_CL85和ACRI_CL215），用一个串联重复（ACRI_CL78）和45S rDNA联合使用可以鉴定清楚冰草所有染色体;利用单拷贝cDNAs为探针的FISH分析结果表明，小麦和冰草基因共线性较差，并且冰草2P、4P、5P、6P和7P染色体都发生了染色体重排，为小麦族的基因组进化提供了新的见解，也为促进冰草基因组的优异基因导入小麦提供了理论支撑。冰草P基因组特异分子标记见表2。

4 冰草有益性状在小麦改良中的利用

普通小麦-冰草异染色体系中含有抗旱、抗寒、抗病（白粉、条锈、叶锈等）以及高产（分蘖多、穗粒数多等）等性状的基因[22，31-34， 38， 63]，将冰草的优异基因导入小麦，为小麦遺传育种改良提供了丰富的遗传资源[22， 31， 47，59，60]。

李立会等[22]对普通小麦Fukuho×冰草Z559的杂种后代（BC2F3、BC3F2、BC4F1和BC5）进行了农艺性状、抗病性、蛋白质含量和抗逆性分析，结果发现，一些遗传稳定（异源易位系）的杂种后代表现为株型好、大穗多粒、兼抗白粉病和黄矮病、蛋白质含量高（17.01%～20.72%）、抗旱和抗寒等特点，说明不仅已将冰草Z559的优异基因导入小麦，而且这些外源优异基因能够在小麦背景下充分表达。Soliman等[18]获得的小麦-冰草双二倍体材料对小麦叶锈病和白粉病具有较强抗性。Han等[32]检测到普通小麦-冰草含6PⅠ型染色体的附加系携带抗白粉病基因。Lu等[56]发现小麦-冰草渐渗系普冰74携带一个抗白粉病显性基因，位于小麦染色体臂5DS上。小麦-冰草6P易位系对小麦叶锈病、白粉病也具有较强抗性[44， 47，59，60]。Zhang[61]和Jiang[62]等分别将抗条锈病基因和抗叶锈病基因定位于冰草6P短臂末端20%的区间内和冰草2PL染色体片段长度为0.66～0.86 cM的区间内。