龙眼蜜中挥发性成分的GC／MS指纹图谱差异分析

王华堂， 黄文忠， 朱颖茵， 张学锋， 赵红霞

(1.广东省生物资源应用研究所／广东省动物保护与资源利用重点实验室／广东省野生动物保护与利用公共实验室，广东广州510260；2.湖南文理学院生命与环境科学学院，湖南 常德 415000；3.法国笛卡尔大学，法国 巴黎75006)

香味是蜂蜜中最受喜爱的特性之一，天然蜂蜜常具有特殊的花香气味.一般情况下，蜂蜜的香味主要取决于其中的挥发性成分，且不同蜜源的蜂蜜间差异很大[1].此外，蜂蜜中的挥发性成分还可能受蜜蜂自身代谢、储存方式、热加工或环境微生物等影响[2].国外对蜂蜜挥发性成分的研究已有较长的历史，主要集中在分析单一种类蜂蜜挥发性成分标记物的研究.如Radovic et al[3]通过对43种不同蜜源植物和地理来源的蜂蜜样品进行挥发性成分分析，发现2-乙酰基呋喃的缺失可作为葡萄牙和西班牙地区迷迭香蜂蜜的挥发性成分标记物；Castro-vázquez et al[4]通过对欧洲圣橡蜂蜜、橡树蜂蜜以及二者混合蜂蜜样品的挥发性成分进行对比分析，发现反式橡木内酯可作为西班牙地区橡树蜂蜜的挥发性成分标记物.然而，利用单一的挥发性成分标记物区别不同来源的蜂蜜比较困难，且大多数蜂蜜香味物质的形成常依赖于多种挥发性成分[5].如芳樟醇、氧化芳樟醇、α-松油醇、松油醇、α-甜橙醛、β-甜橙醛、丁香醛和丁香醇的异构体均对西班牙地区柑橘蜜香味的形成具有重要影响[6]，而1-苯基-2，3-丁二酮、苯乙腈、香芹酚、3-羟基-4-苯基-2-丁酮和3-羟基-1-苯基-2-丁酮均对希腊地区百里香蜜香味的形成具有重要影响[7].

蜂蜜的挥发性成分指纹图谱是指能够鉴别不同蜜源植物、不同地区来源或掺假蜂蜜等样本间差异的色谱图谱[8-9].对于单花蜜而言，由于同种蜜源植物具有整体的遗传相似性，因此可利用蜂蜜的挥发性成分指纹图谱对单花蜜进行准确鉴别[10].如王文静[11]利用高效液相色谱建立了具有较强特征性和专属性的洋槐蜂蜜糖类化合物指纹图谱；夏立娅等[12]利用顶空固相微萃取和气相质谱联用法建立了由14个共有峰组成的枣花蜂蜜挥发性成分指纹图谱；涂世等[13]则采用超声波辅助萃取法，并结合气相—氢火焰化离子检测和气相质谱联用技术建立了油菜单花蜜的挥发性成分指纹图谱.

龙眼蜜，又称“桂圆蜜”，是蜜中上品，主要分布于我国华南地区以及台湾地区，如广东、广西、福建等省，其蜜色为琥珀色，食味甘甜，不易结晶，且因其具有特殊的养血安神和补中益气等功效而深受消费者的偏爱.然而，由于当前龙眼蜜标准化质量控制指标的缺乏，导致市场上依然存在诸多劣质或掺假蜜；且同时由于国内市场上中蜂Apis cerana cerana蜂蜜的价格是意蜂A.mellifera ligustica蜂蜜的3～5倍，在利益驱使下，市场上亦常出现使用意蜂龙眼蜜掺入或冒充中蜂龙眼蜜的现象，给中蜂的养殖者带来了较大损失，也容易引发消费者的信任危机[14].本试验旨在通过分析检测中蜂龙眼蜜和意蜂龙眼蜜挥发性成分的差异，利用指纹图谱技术的优势，分别建立中蜂龙眼蜜和意蜂龙眼蜜的挥发性成分指纹图谱，旨在为龙眼蜜的科学评价提供技术支持.

1 材料与方法

1.1 材料

供试龙眼蜜样品均为原蜜，分别采自福建省、广东省和广西壮族自治区各龙眼蜜源主产区的11个意蜂蜂场和16个中蜂蜂场，蜂蜜样品及蜜源信息见表1.所有样品均是在龙眼开花流蜜季节，根据国家蜂产品质量溯源管理体系从各个采样地点的蜂农处购得，未经任何加工，采样时间为2018年3—5月.不同采样蜂场间相距至少5 km以上，各样品采样量为200 g，密封置低温（4～6℃）处保存.

表1 样品采集及蜜源信息Table 1 Nectar source information

仪器与设备有7890N／5975B气质联用仪（美国安捷伦公司）、DF-1CD电热恒温水浴锅（江苏常州市亿能实验仪器公司）.

1.2 方法

1.2.1 蜂蜜挥发性成分的萃取 参照梁虹瑜等[15]方法，将20.00 g龙眼蜜样品和磁力搅拌子装入100 mL顶空萃取瓶中，调整磁力搅拌子的转速为180 r·min-1，充分混匀，于70℃保持10 min后，利用50 μm／30 μm固相微萃取头萃取50 min.萃取结束后，取出萃取头，并迅速插入气相（gas chromatography，GC）／质谱（mass spectrometry，MS）进样口内解吸附5 min进样.每次萃取前，萃取头应在250℃条件下老化5 min.

1.2.2 GC／MS 条件 GC 条件：采用安捷伦公司的 HP-5MS 色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），进样口温度250℃，不分流进样，载气为高纯He（＞99.999%）.色谱柱箱的升温程序为：起始温度50℃，保持3 min；3℃·min-1升温至170℃；15℃·min-1升温至250℃，保持3 min.MS条件：溶剂延迟3 min，接口温度280℃，离子源温度230℃，四极杆温度150℃，电子能量70 eV，全扫描模式，扫描间隔时间0.1 s，扫描质量范围为30～450 amu.

1.3 数据处理

参照夏立娅等[12]的方法，并稍作改进.将各龙眼蜜样品挥发性成分的总离子流图导入中药指纹图谱相似度评价系统软件（2012版）[16]，以相对保留时间标定色谱峰，经过峰匹配得到共有峰，特征峰选取原则为主要特征峰与相邻峰的分离度达到1.2以上，然后建立指纹图谱.GC／MS的检测结果则运用安捷伦公司的NIST2017质谱库进行检索分析，且部分物质与标准品进行比对，以确认挥发性成分的化学组成.挥发性成分的相对百分比含量采用面积归一法确定.

2 结果与分析

2.1 精密度和稳定性的检测结果

取同一蜂蜜供试样品，在设定条件下连续进样5次，各主要色谱峰相对峰面积的相对标准偏差（RSD）小于1.97%（＜5%），各主要色谱峰保留时间的RSD小于0.07%，表明分析方法的精密度良好，达到指纹图谱分析技术要求中关于分析方法保持稳定的要求.取同一蜂蜜供试样品，分别于0、4、8、16和24 h进样，在设定条件下测得各主要色谱峰相对峰面积的RSD小于3.89%，各主要色谱峰相对保留时间的RSD小于0.11%，表明供试蜂蜜样品在24 h内保持稳定，达到指纹图谱分析技术要求中关于待测样本保持稳定的要求.

2.2 龙眼蜜样品中挥发性成分的种类

将从所有龙眼蜜样品中鉴别出的38种挥发性成分进行分类汇总，发现龙眼蜜样品中的挥发性成分主要分属于醛类、醇类、酮类、烷烃类、萜烯类和酯类，其中醇类的含量最高，达42.11%（图1）.

图1 龙眼蜜样品中挥发性成分的种类Fig.1 Sorts of volatile components in longan honey samples

2.3 龙眼蜜挥发性成分指纹图谱的建立

采用多点校正法，对16个中蜂龙眼蜜样品的挥发性成分色谱峰进行匹配，并自动生成对照指纹图谱（图2），该指纹图谱共由38个色谱峰和16个共有峰组成，且不同产地中蜂龙眼蜜样品的挥发性成分气相色谱图与系统生成的指纹图谱的相似度均大于91%；对11个意蜂龙眼蜜样品的挥发性成分色谱峰进行匹配，并自动生成对照指纹图谱（图3），该指纹图谱共由38个色谱峰和15个共有峰组成，且不同产地意蜂龙眼蜜样品的挥发性成分气相色谱图与系统生成的指纹图谱的相似度均大于90%，表明各色谱峰的相似性较好.由标准指纹图谱分别得到共有峰的相对保留时间及其各挥发性成分的谱库检索结果和相对百分比含量见表2.其中，中蜂龙眼蜜样品中顺式芳樟醇氧化物、反式芳樟醇氧化物和大马士酮的相对百分比含量分别为15.18%±0.61%、21.87%±1.28%和 2.30%±0.13%，均显著高于意蜂龙眼蜜样品中这 3种挥发性成分的相对百分比含量，意蜂龙眼蜜样品中这3种挥发性成分的相对百分比含量分别为11.97%±1.05%、17.15%±1.64%和 1.28%±0.25%；而意蜂龙眼蜜样品中苯乙醛、4-氧代异佛尔酮、丁香醛 C、丁香醛 D 和 2，2，6-三甲基-6-乙烯基四氢-2H-吡喃-3-醇的相对百分比含量分别为 2.74%±0.34%、4.68%±0.31%、3.40%±0.19%、1.82%±0.10%和 3.85%±0.53%，均显著高于中蜂龙眼蜜样品中这 5 种挥发性成分的相对百分比含量，中蜂龙眼蜜样品中这5种挥发性成分的相对百分比含量分别为1.15%±0.19%、2.84%±0.15%、1.82%±0.20%、0.91%±0.10%和 2.46%±0.13%.

图2 中蜂龙眼蜜样品挥发性成分色谱峰的匹配结果Fig.2 Matching results of chromatographic peaks with the volatile components in longan honey samples brewed by A.cerana cerana

图3 意蜂龙眼蜜样品挥发性成分色谱峰的匹配结果Fig.3 Matching results of chromatographic peaks with the volatile components in longan honey samples brewed by A.mellifera ligustica

表2 中蜂龙眼蜜和意蜂龙眼蜜标准指纹图谱共有色谱峰的信息1）Table 2 Common GC／MS fingerprints shared by longan honey samples brewed by A.cerana cerana and A.mellifera ligustica

2.4 中蜂龙眼蜜和意蜂龙眼蜜挥发性成分的差异

对比中蜂龙眼蜜和意蜂龙眼蜜挥发性成分的GC／MS指纹图谱，发现乙酸苯乙酯这种挥发性成分仅在中蜂龙眼蜜中检出，而在意蜂龙眼蜜中无检出（图4）.中蜂龙眼蜜样品中乙酸苯乙酯的相对百分比含量为2.22%±0.40%（表 2）.

图4 中蜂龙眼蜜和意蜂龙眼蜜挥发性成分的GC／MS指纹图谱Fig.4 GC／MS fingerprint of the volatile components in longan honey samples brewed by A.cerana cerana and A.mellifera ligustica

3 结论与讨论

建立单花蜜挥发性成分的GC／MS指纹图谱，可对单花蜜挥发性成分中所含有的化合物组成及数量进行整体描述与评价，进而有助于提高单花蜜产品的质量水平[12].本试验从供试龙眼蜜样品的挥发性成分中共鉴别出38种化合物，分别建立了由16个共有峰组成的中蜂龙眼蜜挥发性成分GC／MS指纹图谱，以及由15个共有峰组成的意蜂龙眼蜜挥发性成分GC／MS指纹图谱.其中，鉴别出的龙眼蜜挥发性成分种类主要包括醛类、醇类、酮类、烷烃类、萜烯类和酯类6类物质，且中蜂龙眼蜜与意蜂龙眼蜜样品的总离子流图色谱峰形整体相似，说明中蜂龙眼蜜和意蜂龙眼蜜样品中的挥发性成分相近，种类差别较小.但由于各类挥发性成分呈现出的相对百分比含量差异明显，因此，各类挥发性成分对龙眼蜜香味的贡献也应存在明显差异.如中蜂龙眼蜜样品中顺式芳樟醇氧化物、反式芳樟醇氧化物和大马士酮的相对百分比含量，均显著高于意蜂龙眼蜜样品中这3种挥发性成分的相对百分比含量；而意蜂龙眼蜜样品中苯乙醛、4-氧代异佛尔酮、丁香醛C、丁香醛D和2，2，6-三甲基-6-乙烯基四氢-2H-吡喃-3-醇的相对百分比含量，均显著高于中蜂龙眼蜜样品中这5种挥发性成分的相对百分比含量.在6类物质中，醇类物质不仅种类最多，其相对物质含量也最高，说明醇类化合物可能是中蜂龙眼蜜和意蜂龙眼蜜香味形成的主要来源，这与Vilma et al[17]所报道的醇类化合物是蜂蜜主要香味物质来源的结果相一致.

本试验结果还表明，乙酸苯乙酯这种挥发性成分仅在中蜂龙眼蜜中检出，在意蜂龙眼蜜中无检出，说明不同蜂种对龙眼蜜挥发性成分的最终组成存在明显影响.蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜或蜜露，在巢脾内经充分酿造而成的天然甜味物质.然而，蜂蜜酿造成熟的过程不仅涉及到水分的蒸发等物理变化过程，而且还涉及到工蜂不同唾腺酶的分泌催化、储存方式以及环境中耐高糖酵母菌种的后续分解等复杂的化学变化过程[18].其中，蜂蜜中水分蒸发的快慢等物理变化过程一般被认为对蜂蜜最终挥发性成分的组成无明显影响，而邱巨香等[19]通过PDA培养基分离试验发现，相同品种的中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜中的耐高糖酵母菌种为相同种.因此，初步推测不同蜂种所酿造的龙眼蜜挥发性成分的差异可能主要与不同蜂种工蜂分泌的唾腺酶种类上存在差异而所致.

当前，随着蜂蜜掺假方式的多样化，简单地测定单个或几个特征物质含量的蜂蜜质量控制方法已很难满足当前越来越高的蜂蜜质量控制要求.因此，建立全面而系统地反映蜂蜜整体质量水平的蜂蜜挥发性成分GC／MS指纹图谱，可为蜂蜜的科学评价提供参考方法.本试验对我国龙眼蜜主要产区的16个中蜂龙眼蜜和11个意蜂龙眼蜜样品进行了挥发性成分分析，建立了符合指纹图谱技术要求的中蜂龙眼蜜和意蜂龙眼蜜挥发性成分GC／MS指纹图谱，并报道了不同蜂种对其所酿造的龙眼蜜挥发性成分的差异.但因蜂蜜采集时间的差异性，蜂蜜挥发性成分的提取方法、分析条件和仪器等复杂因素对蜂蜜挥发性成分指纹图谱的影响，也可能存在一定程度上的误差，还有待于进一步研究.