药用植物中具有抗真菌活性的内生真菌及其次级代谢产物的研究

武艳霜,陆 悦,朱作斌,陈 莹,李 颖*

(1徐州医科大学医学技术学院， 徐州221004；2徐州医科大学基础医学院遗传学教研室， 徐州221004)

近年来，随着广谱抗生素的大量使用，以及器官移植、放化疗、血液透析等治疗方法的广泛应用，全球艾滋病人数量的增加，使得临床免疫缺陷患者的数量急剧增加，真菌感染的发病率和死亡率逐渐上升，真菌感染已成为临床重要的感染病症之一[1]。在众多的致病真菌中，念珠菌属(Candidaspecies)是最常引起临床真菌感染的病原菌，其中白色念珠菌(C. albicans)占比最高[2]。目前虽有大量的抗真菌药物用于临床真菌感染的治疗，但随着药物剂量的提高以及作用时间的延长，真菌耐药性会迅速出现并逐渐蔓延。耐药性的出现增加了真菌感染的治疗难度和治疗费用，同时，抗真菌药物本身的毒副作用也限制了其临床应用，因此亟需寻找并开发高效低毒且不易耐药的新型的抗真菌药物[3]。

天然产物是新药研发的重要资源。据统计，自1981年至2012年间，美国FDA批准的新药中，超过一半以上的抗感染药物(69%)和抗肿瘤药物(75%)都与天然产物有关。

植物内生菌(endophyte)是指存活于健康植物组织中，却不会使宿主植物表现出明显感染症状的微生物[4-5]，它是植物微生态系统的重要组成部分。内生菌与宿主植物之间长期协同进化，两者间呈互利共生关系[6]：植物把光合作用产物、水和矿物质提供给内生菌，并给予内生菌以保护；同时内生菌代谢产物能刺激植物生长发育，参与植物活性成分和次生代谢产物的合成，使宿主对外界环境的胁迫有很强的抗逆性，因此植物内生菌中更易产生具有生物活性的次级代谢产物。

天然产物虽然是新药研发的重要资源，但由于其化学结构的复杂性或特殊性，往往不能通过化学方法直接合成，需要通过提取分离方法获取，因此，尤其对于植物来源的活性天然产物，存在资源短缺的问题。对植物内生真菌的研究是解决植物资源紧缺问题的重要手段。紫杉醇是一种重要的抗肿瘤药物，广泛应用于临床癌症的治疗。紫杉醇化学结构特殊，不易人工合成，主要依靠从红豆杉树皮中直接提取分离。随着对植物内生菌研究的深入，人们从红豆杉、紫杉、水松、榛树等植物中分离得到了多株能够代谢产生紫杉醇的内生真菌，为紫杉醇的制备提供了一个新的资源[7-9]。

中药是中华民族的瑰宝，人们可利用植物、动物、矿物等来治疗各种疾病，其中，药物植物是重要的组成部分。近代研究发现，药物植物之所以能够治疗疾病，与其中含有的活性成分密不可分。人们在药用植物中发现了大量的具有抗真菌活性的天然产物，而这些药物植物的内生真菌同样能够代谢出多种具有抗真菌活性的天然产物。本文对目前已发现的几种药用植物内生真菌次级代谢产物的抗真菌活性的研究进展进行综述，为从药用植物内生真菌中寻找先导化合物，开发新型抗真菌药物提供参考。

1 黄芩

图1 黄芩苷分子的化学结构

黄芩(Scutellaria baicalensisGeorgi)，别名山茶根、土金茶根，是唇形科黄芩属多年生草本植物。具有清热燥热、泻火解毒、止血、安胎等功效。研究表明, 黄芩的活性成分黄芩苷(图1)在抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗感染、抗氧化和治疗心血管疾病等方面具有一定的作用，并具有较好的抗真菌活性[10]。李青连等[11]从野生黄芩的组织中分离出97株内生真菌，其中 33 株来自生长期植株, 64 株来自成熟期植株，并将其中95株内生真菌对白色念珠菌等14种指示菌进行抗菌活性实验。结果发现：其中91 株内生真菌对一种或多种指示菌具有抑菌活性, 占分离菌株总数的 95.8%，说明其有广泛的抗菌活性。从成熟期黄芩中分离到的 62 株内生真菌菌株对白色念珠菌有较高的拮抗作用，有拮抗活性的菌株为14株，占总数的22.58%。从成熟期黄芩中分离得到菌株的部位看：叶子中分离出来的内生真菌菌株对白色念珠菌没有拮抗活性；从茎中分离出来的内生真菌菌株有两株有抗念珠菌活性，为Arbuscula属，抑菌圈直径分别是d ≤ 10 mm、10 mm ＜ d ＜ 15 mm，抑菌效果较好；从根中分离出来的内生真菌菌株有四株有抗念珠菌活性，为Mucor、Alternaria、Trichosporiella、Minimedusa属，前三个抑菌圈直径均是10 mm ＜ d ＜ 15 mm，最后一个抑菌圈直径是d ≤ 10 mm，抑菌效果较好。总的来说，从成熟期黄芩根中分离得到的内生真菌菌株有抗白色念珠菌活性的较多，抗菌活性较好，因此，我们可以重点对这些菌株中的抗菌活性成分进行研究，以扩大药用资源。

张黎光等[12]采用常规微生物分离纯化方法从表面消毒的黄芩各个组织中分离出17株内生真菌。利用薄层层析分析法和高效液相色谱法从分离出的17株内生真菌中筛选能产生黄芩苷的内生真菌菌株。结果表明：J1及H3两株内生真菌可以在人工培养基中产生与宿主相同或相似的活性成分黄芩苷。采用形态学和分子生物学方法对产黄芩苷菌株进行鉴定，可以确定产黄芩苷的内生真菌J1及H3均属于青霉菌属。

熊英等[13]研究发现黄芩苷对白色念珠菌有较好的抗菌活性，其最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度( MFC) 均为1. 0～2. 0 μg/mL。同位素前体掺入试验发现，黄芩苷对[3H]-TdR，[3H]-UdR 和[3H]-亮氨酸参入白色念珠菌过程有抑制作用，推测黄芩苷的抑菌作用是通过抑制白色念珠菌的DNA、蛋白质生物合成完成的。

张美玲等[14]研究了黄芩中能有效抗白色念珠菌的活性成分，她们从黄芩中提取了黄芩苷、黄芩苷元，并将黄芩苷与NaOH反应生成黄芩苷盐。研究将这3种物质对临床深部真菌感染分离的3株白色念珠菌进行抗菌活性研究，观察其抑菌圈直径大小。结果表明：黄芩苷无抗白色念珠菌活性，黄芩苷盐有一定的抗白色念珠菌活性，而黄芩苷元的抗白色念株菌活性最好。黄芩苷盐药粉、黄芩苷元、黄芩苷对 3 株白色念珠菌抑菌环直径分别为( 18.7 ± 2.9) mm、( 12.8 ± 1.5) mm、0 mm。张美玲等[15]又进一步从甘肃黄芩中提取黄芩苷，并利用强酸对黄芩苷加热水解，获取有效活性成分黄芩苷元，制成黄芩苷元制剂。并对临床收集分离的假丝酵母菌进行抑菌活性研究，测定黄芩苷元制剂的MIC。结果表明：黄芩苷元制剂对白色念珠菌有最强的抑菌活性，药物用量为0.50 ～ 0.55 mL，MIC为0.956 μg/mL，其中标准菌株MIC为0.956 μg/mL。可见，黄芩苷的活性成分黄芩苷元抗念珠菌活性极强。而黄芩中分离出来的内生真菌能产生黄芩苷，黄芩苷中能获取黄芩苷元，所以对黄芩内生真菌的有效利用能扩大药用资源，为我们提供更多的药物来源。研究发现[16-17]一定浓度的黄芩苷对白色念珠菌芽管的形成及粘附性有较强的抑制作用。100 μg/mL 的黄芩苷对芽管抑制作用与两性霉素 B 的作用相当，而单味药黄芩对体外白色念珠菌的生物膜也具有明显的抑制作用。

周智兴等[18-19]运用分光光度法检测黄芩苷对白色念珠菌中琥珀酸脱氢酶 (SDH)、细胞色素C氧化酶 (CCO)、Ca2+-Mg2+-ATPase3种酶活性的影响，并研究了黄芩苷对白色念珠菌细胞周期的影响。研究表明：黄芩苷抗白色念珠菌作用明显，并可降低白色念珠菌SDH酶 、白色念珠菌 Ca2+-Mg2+-ATPase的活力。生化实验表明，黄芩苷能使白色念珠菌线粒体SDH酶的活力降低，黄芩苷浓度越高, SDH酶活力越低。

Wu等[20]研究表明，SDH活性发生变化时线粒体的损伤也同时出现，并与线粒体的升降数目一致, 直接影响氧化磷酸化过程。他们推测：黄芩苷可能通过降低SDH酶的活力来损伤白色念珠菌线粒体, 从而达到抑制白色念珠菌生长的作用。而且黄芩苷可使白色念珠菌处于S /G2 /M 细胞周期的细胞数目下降，提示其生长受到了抑制，从而抑制白色念珠菌增殖，进一步体现抗白色念珠菌活性。

冯鑫等[21]研究了黄芩苷对白色念珠菌凋亡的影响，结果表明：黄芩苷可以通过降低细胞线粒体膜电位MMP和促进细胞内活性氧(ROS)的累积即线粒体途径而诱导白念珠菌凋亡。

吴秀珍等[22]探讨黄芩苷对白色念珠菌超微结构的影响，电镜下发现：黄芩苷作用白色念珠菌后细胞壁和细胞膜先发生变化, 接着出现细胞器和细胞核的损伤，直至细胞出现坏死崩裂性变化。由此推测黄芩苷是通过破坏真菌细胞壁发挥抗白色念珠菌活性。

2 黄连

黄连(Coptis chinensisFranch.)，又名味连、川连、鸡爪连，属毛茛科、黄连属多年生草本植物。有清热燥湿，泻火解毒之功效。小檗碱，又名黄连素，是从黄连等中草药中提取分离到的一种异喹啉类生物碱物质[23]。其作为疗效确切的广谱抗菌药物，对多种细菌、真菌、霉菌、病毒等有抑制和杀灭作用[24]。并且有研究表明，其有较好的抗白色念珠菌的功效[25]。厉秀秀[26]从黄连中分离出10株内生真菌，并测得其中4株可以产生小檗碱(图2)，他们分别是：内生真菌 HL-A，BC，C，D，产量分别为 1.83、0.63 、1.19 、1.28μg/mL。通过形态学以及分子生物学方法将 HL-A，BC，D 确定为拟星衣属(Arthopyreniaceae)，拟茎点霉属(Phomopsis)和拟隐孢壳属(Cryptosporiopsis)，而HL-C尚不能确定。

向建辉[27]从黄连中分离出15株内生真菌，并采用色谱法对菌株 HL-Y-3 的菌丝进行检测，发现其能产生小檗碱，同时利用核磁共振分析和质谱分析验证菌丝中的小檗碱与盐酸小檗碱对照品的结构一致，其含量9.313 μg/g(小檗碱/菌丝干重)。

张峰华等[28]对产小檗碱的黄连内生真菌HL-Y-3菌株做了深入的研究，发现HL-BC菌株比HL-Y-3菌株产小檗碱产率低，产量分别为0. 664μg/mL、9.313μg/g。因此可以重点培养和研究HL-Y-3菌株，以扩大小檗碱来源，最终扩大抗白色念珠菌制剂的来源。

图2 小檗碱分子的化学结构

Freile 等[29]的研究发现，小檗碱在体外对多种分离于人体的白色念珠菌有较好的抑制作用。姜远英等[30]研究表明小檗碱与氟康唑在体外联用有很好的协同抗氟康唑耐药的白念珠菌作用。孔德道等[31]研究表明小檗碱与克霉唑在体外联用有很好的协同抗氟康唑耐药的白念珠菌作用。傅子晋[32]的研究表明，小檗碱与咪康唑体外联用能够协同对抗耐药白色念珠菌。并推测二者联合作用时，小檗碱通过增加真菌细胞不可逆转的慢性损伤，从而体现其持久稳定的对真菌细胞的杀伤作用。

Xu等[33]认为小檗碱协同氟康唑对抗耐药白色念珠菌的机制是升高白色念珠菌胞内的活性氧以及加强了线粒体有氧呼吸作用，从而抑制白色念珠菌，达到更好的抗菌效果。吴玲等[34]研究表明耐唑类药物白色念珠菌能过度表达耐药基因 CDR1，CDR1 通过转录因子 Tac1p 结合到启动子的顺式药物反应元件(DRE)上进行性转录激活而使白色念珠菌耐药。小檗碱协同氟康唑抗耐药白色念珠菌的机制是，二者联合应用时，小檗碱能够抑制Cdr1p的运输功能和CDR1mRNA上调，干扰蛋白-DRE 转录激活复合物，并结合到 CDR1 的 DRE 上。从而阻止耐唑类药物白色念珠菌过度表达基因CDR1而耐药。梁蓉梅等[35]研究小檗碱作用于白色念珠菌的靶位是剂量依赖性非竞争抑制24-甲基转移酶(24-M ST)，小檗碱对此酶的抑制作用显著，在真菌合成麦角甾醇的过程中，小檗碱阻止了真菌对合成麦角甾醇的必需物质L-甲基-蛋氨酸的利用，最终导致24-二烯-3β醇、麦角甾烷-8的堆积和麦角甾醇的缺乏，从而抑制白色念珠菌增殖。

3 银杏

银杏(Ginkgo bilobaL.)，为银杏科、银杏属落叶乔木，具有活化石之称。具有抑菌杀菌、清热解毒等功效，是珍贵的药用资源。其组织内含有丰富的内生菌，研究人员从中分离出500余株内生真菌，郭建新等[36]采用菌丝生长抑制法测定了分离出来的内生真菌对7种植物病原真菌的抑制作用。结果表明302株具有抗菌活性，所占比例较高。因此，银杏内生真菌是一个潜在而又丰富的抗菌新药资源库。

于洪升等[37]采用微量稀释法测试银杏内生真菌粗提物抗病原真菌活性，结果发现共计5株内生真菌粗提物的抗白色念珠菌活性较为显著，分别为：T-1, T-16,T-33, T-35,T-1-2-1, T-3-8-1，主要属于拟茎点霉属，毛壳属，曲霉属及青霉属内生真菌。而青霉属的T-1-2-1内生真菌抗白色念珠菌活性最为显著，MIC80为8 μg/mL。李虎强等[38]从浙江天目山分离出56株银杏内生真菌，发现其中有9株内生真菌的粗提物有较好的抗白色念珠菌活性，他们同样发现编号为T-1-2-1青霉属的内生真菌粗提物抗菌效果最好。因此，我们可以重点对T-1-2-1菌株的内生真菌粗提物成分进行研究，以期待能够找到有效的抗白色念珠菌的天然产物。

李涵等[39]对银杏内生真菌进行抗菌活性筛选，发现其内生真菌菌株L43的抗菌谱最广，对白色酵母菌有较强的抗菌效果，最小抑菌浓度 ≤ 12.5%，其发酵液萃取组分的抗白假丝酵母菌活性检测结果是无水乙醇、乙酸乙酯及二氯甲烷萃取粗提取具有抗菌活性，其 MIC 分别为1mg/mL、1mg/mL及0.25mg/mL。其中二氯甲烷组分的抗菌活性最高。因此，重点对二氯甲烷萃取粗提物组分进行研究，有利于发现抗白色念珠菌的天然产物，扩大药用资源。

4 虎杖

虎杖(Reynoutria japonicaHoutt.)，具有利湿退黄，清热解毒，散瘀止痛，止咳化痰的功效。用于湿热黄疸，淋浊，带下，风湿痹痛等。曾松荣等[40]从虎杖中分离出3株具有抑制白色念珠菌作用的内生真菌，它们分别属于无孢菌类、青霉属和曲霉属。这3株内生真菌的抗白色念珠菌实验结果：抑菌圈直径大小分别为9、12、19 mm，其中曲霉属的内生真菌抑菌效果最好。张渝华等[41]在虎杖根中提取出白藜芦醇(图3)，并测得其对白色念珠菌有一定的抑菌作用。刘芸等[42]从虎杖中分离得到的15株内生真菌中有5株能产生白藜芦醇，产量最高菌株可产生1.528 μg/mL的白藜芦醇。董倩[43]从虎杖中筛选出12株能产白藜芦醇的内生真菌，最高产量可达1.440 mg/mL。彭浩[44]从虎杖中提取了116株内生真菌，发现其中有两株内生真菌产白藜芦醇(苷)，其中一株白藜芦醇的产量为4.812 mg/mL。这说明虎杖内生真菌可以产生与虎杖活性成分相同生物活性物质。 张瑞[45]研究出白藜芦醇能抑制白色酵母菌可能是通过改变真菌细胞自身作用和与生物膜黏附的表面之间的疏水性、化学键等，来改变二者配体和受体的特异性结合，最终导致真菌生物膜细胞的脱落；或是白藜芦醇直接作用于白色酵母菌生物膜分泌的甘露糖蛋白，改变细胞的疏水性，使细胞之间不能粘附；或是药物渗入生物膜后吸附于白色酵母菌细胞壁上，干扰其合成，使细胞壁破损并进入细胞内部，抑制细胞的生长繁殖，导致真菌死亡。

图3 白藜芦醇分子的化学结构

5 雷公藤

雷公藤(Tripterygium wilfordiiHook. f.)为卫矛科雷公藤属，又名黄藤、断肠草，有清热解毒、消肿止痛、祛风除湿等功效。内生真菌在雷公藤中普遍存在，宋萍等[46]利用组织块法对雷公藤植物内生真菌进行了分离，获得了22株形态型不同的内生真菌。他们发现雷公藤内生真菌的菌丝体和发酵液的提取物有较好的抗白色念珠菌活性。其中菌株1#、3#、6#、7#、13#、14#、17#、18#、21#、23#、24#的菌丝体提取物有抗白色念珠菌活性。菌株1#、5#、6#、7#、8#、13#、15#、16#、17#、18#、19#、20#、21#、24#的发酵液提取物有抗白色念珠菌活性。总的来说，雷公藤内生真菌普遍有抗白色念珠菌活性。

Li等[47]从雷公藤中筛选获得了一株对白假丝酵母菌有一定的抑制作用的内生真菌，其能代谢产生一种与肺炎球菌素和棘白霉素化学性质相似的新型的环肽类化合物(图4)，并证明这个新型的环肽类抗生素是对抗白假丝酵母菌的活性成分。

6 越南槐

越南槐(Sophora tonkinensis Gagnep.)是豆科，槐属灌木，具有清热解毒，消炎止痛之效。 姚裕群等[48]对238株越南槐内生真菌进行抗白色念珠菌活性筛选，结果显示，3株内生真菌有抑菌圈产生，其中内生真菌GRPH-0活菌块对白色念珠菌的抑菌圈直径最大，且对其他念珠菌属具有不同程度的抑制作用。

7 展望

图4 环肽类化合物的化学结构

药用植物内寄生有丰富的内生真菌，且这些内生菌的次生代谢产物活性与植物本身有一定的相似性，虽然两者的具体关系、次生代谢产物的合成机制等方面还需要更加深入的研究，但可以推测，药用植物起功效的成分不一定都是植物本身，也有可能是其内生菌的次生代谢产物。同种菌在不同的宿主植物中，或是在相同的宿主植物中但改变其培养条件，其次生代谢产物便具有化学多样性。次生代谢产物是天然产物的重要来源，这使得药用活性物质的来源变得更为广泛[49-51]。据资料统计，新的生物活性物质中51%是内生菌的新品种[52]。因此，相关研究将有利于我国药物的开发和药用植物资源的保护与利用，也有利于利用植物内生菌筛选结构新颖且活性显著的抗菌活性物质。并且，大部分内生真菌均可在人工培养条件下相对快速大量繁殖，通过基因改造等方法，可使特定成分在改造菌株中高产出，为某些活性药物成分如紫杉醇的获取提供新的资源。

然而，目前对内生菌资源利用较少，内生菌的相关研究仍然处于早期水平，植物类群的研究不过数百种，仅涉及了数量庞大的内生菌种类中的很小一部分。内生菌的次生代谢产物虽然种类多，但复杂多样又不稳定，所以相关研究也应该关注这一方面。内生菌暂时无法大规模推广也是开发内生真菌资源的瓶颈。