抑制JNK通路对染料木黄酮诱导肝癌MHCC97-L细胞凋亡及caspase-3和caspase-9活性的影响

刘晟男 钱甜甜 郎慧玲

[摘要] 目的 探討抑制JNK通路对染料木黄酮（Genistein）诱导肝癌MHCC97-L细胞凋亡及caspase-3和caspase-9活性的影响。 方法 实验分为对照组、SP600125（SP）10、20、30 μmol/L组。蛋白质印迹法筛选SP的最适工作浓度。实验分对照组、Gen组、SP组和联用组，倒置显微镜、荧光显微镜和分光光度法分别检测细胞凋亡形态、细胞凋亡指数、caspase-3和caspase-9活化水平。 结果 SP能明显阻断P-JNK蛋白表达（P < 0.01），其最小工作浓度为20 μmol/L。倒置显微镜下，各药物组细胞均出现染色质着色变深或局部凝集的凋亡特征性改变，以联用组细胞变化最为明显。荧光显微镜下，各药物组均可观察到早期凋亡和晚期凋亡细胞。与对照组比较，所有药物组凋亡指数均明显升高（P < 0.01），且联用组高于Gen组和SP组（P < 0.01）。与对照组比较，所有药物组的caspase-3和caspase-9活性均明显升高（P < 0.01）。与Gen组、SP组比较，联用组caspase-3活性最高（P < 0.01），SP组caspase-3活性高于Gen组（P < 0.01）;联用组caspase-9活性高于Gen组（P < 0.01），SP组与Gen组、联用组与SP组caspase-9活性差异均无统计学意义（P > 0.05）。 结论 抑制JNK通路可通过激活caspase依赖的线粒体途径来促进Genistein诱导MHCC97-L细胞凋亡。

[关键词] 染料木黄酮;JNK通路;肝癌MHCC97-L细胞;细胞凋亡

[中图分类号] R735.7          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）12（c）-0019-05

Effect of Genistein inducing liver cancer MHCC97-L cells apoptosis and activity of caspase-3 and caspase-9 through inhibiting JNK pathway

LIU Shengnan1   QIAN Tiantian1   LANG Huiling1   YU Jiaqi1   XIONG Mengqi1   ZHAO Zhongxin2   MEI Qingbu1   LIU Dan1

1.Basic Medical College， Qiqihar Medical University， Heilongjiang Province， Qiqihar   161006， China; 2.Department of General Surgery， the First Affiliated Hospital of Qiqihar Medical University， Heilongjiang Province， Qiqihar   161041， China

[Abstract] Objective To explore the effect of Genistein inducing liver cancer MHCC97-L cells apoptosis and activity of caspase-3 and caspase-9 through inhibiting JNK pathway. Methods The experiment was divided into control group and SP600125 （SP） 10， 20， 30 μmol/L groups. Western blotting was carried out to search the optimum working concentration of SP. The experiment was divided into control， Gen， SP and combined groups. Apoptosis morphology， apoptosis index， activity of caspase-3 and caspase-9 were detected by inverted microscope， fluorescence microscope and spectrophotometry respectively. Results SP obviously blocked the expression of P-JNK protein at a minimum working concentration of 20 μmol/L （P < 0.01）. Under inverted microscope， chromatin became darker or condensate in each drug group， and cell changes most obvious in combined group. Early apoptotic cells and late apoptotic cells were observed under fluorescence microscope. Compared with control group， apoptotic index of all drug groups was significantly increased （P < 0.01）， among which apoptotic index of combined group was highest and pro-apoptotic effect was stronger than that of Gen group and SP group （P < 0.01）. Compared with control group， the activity of caspase-3 and caspase-9 in all drug groups were significantly increased （P < 0.01）. Compared with Gen group and SP group， the activity of caspase-3 in combination group was the highest （P < 0.01）， and the activity of caspase-3 in SP group was higher than that in Gen group （P < 0.01）. The activity of caspase-9 in the combination group was higher than that in the Gen group （P < 0.01）， while the activity of caspase-9 in the SP group and Gen group and the combined group and the SP group have no significant differences （P > 0.05）. Conclusions These results suggest that inhibition of JNK pathway can promote the apoptosis of Gen induced MHCC97-L cells by activating the caspase-dependent mitochondrial pathway.

[Key words] Genistein; JNK pathway; Liver cancer MHCC97-L cells; Apoptosis

目前肝癌是全球癌症死亡的第四大原因[1]，是中国癌症死亡的第二大原因[2]，尽管在预防、筛查、诊断和治疗肝癌方面的技术都取得了新进展，但肝癌的发病率和死亡率仍持续上升。值得关注的是女性患肝癌的风险低于男性[3-4]，这种差异与雌激素水平有关[5-6]。染料木黄酮（Genistein，简称Gen）是一种具有雌激素活性的天然物质，最新的研究表明[7]，膳食摄取Gen可通过caspase途径增加肝癌细胞凋亡，抑制肝癌的发生和发展。逃避凋亡是癌症的特征之一[8]，c-Jun氨基末端激酶（JNK）是调控细胞凋亡的重要信号通路，在肝癌细胞系、肝癌组织样本和肝癌异种移植瘤中，JNK1的活性升高[9]，且与患者预后较差有关[10]。SP600125（SP）是一种强效的JNK通路抑制剂，可以抑制JNK磷酸化。尽管Gen是一种已知的肝癌抑制因子，但其作用机制尚未阐明。基于JNK与凋亡的密切联系，本研究以人肝癌MHCC97-L细胞为研究对象，在课题组的前期研究基础之上[11-13]，探讨抑制JNK通路对caspase依赖的线粒体凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 主要材料

人肝癌MHCC97-L细胞购自复旦大学肝癌研究所。Gen（批号：G6649-25mg）购自Sigma公司;SP（批号：A2714）购自Santa Cruz公司;DMEM高糖培养液（批号：AC11223264）购自Hyclone公司;胎牛血清（批号：20170713）购自杭州四季青公司;caspase-3（批号：2018-02-10）、caspase-9（批号：2018-03-03）蛋白活化检测试剂盒和Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒（批号：20170327）购自南京凯基生物公司;T-JNK多克隆抗体（批号：B3901）和P-JNK （T183/Y185）多克隆抗体（批号：B6701）購自Immunoway公司;β-actin多克隆抗体（批号：12cm81）购自武汉博士德生物公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养  MHCC97-L细胞用含10% FBS的DMEM高糖培养液置于37℃、5% CO2培养箱中培养。实验分两个系列组，第一系列分为对照组、SP 10、20、30 μmol/L组;第二系列分为对照组、Gen组（80 μmol/L）、SP组（20 μmol/L）和联用组（SP 20 μmol/L+Gen 80 μmol/L）。取状态良好的对数生长期细胞用于后续实验。

1.2.2 蛋白质印记法筛选SP的最适工作浓度  细胞以5×105个/孔接种于6孔板，加入第一系列处理因素的培养液2 mL，处理6 h后，收集细胞，提取细胞蛋白，BCA法进行蛋白定量，调整样品蛋白浓度为2 μg/μL，样品蛋白煮沸变性。取各组样品蛋白30 μg上样，经SDS-PAGE电泳分离后，转移至NC膜上，封闭2 h，TBS洗涤3次，一抗P-JNK（1∶1000）、T-JNK（1∶1000）、β-actin（1∶400）4℃孵育过夜，TBST洗涤3次，HRP标记二抗室温2 h，TBS洗涤2次，TBST洗涤1次，ECL发光，显影，定影，目的蛋白表达量用相对灰度值表示。

1.2.3 倒置显微镜观察细胞的形态学变化  细胞以1×105个/孔接种于12孔板，加入第二系列处理因素的培养液1.5 mL，处理48 h后，倒置显微镜下观察细胞的数量及形态学变化。

1.2.4 荧光显微镜检测细胞凋亡指数  细胞以5×104个/孔接种于24孔板，加入第二系列处理因素的培养液1 mL，处理48 h后，PBS洗涤细胞2次，加入Annexin V-FITC和PI的混合液，室温避光反应5 min，于荧光显微镜下，用双色滤光片观察，Annexin V-FITC呈绿色信号，PI呈红色信号。在高倍镜（400×）下随机计数5个视野，计算各组细胞凋亡指数，用凋亡细胞数与细胞总数的比值来表示。

1.2.5 分光光度法检测caspase-3、caspase-9活化程度  细胞以3×106浓度接种于60 mm培养皿中，加入第二系列处理因素的培养液5 mL，培养48 h后，收集细胞，抽提细胞蛋白，BCA法进行蛋白定量，调整样品蛋白浓度为2 μg/μL。取50 μL的样品蛋白，加入caspase-3或caspase-9 Substrate，37℃避光孵育4 h，于酶标仪检测405 nm的吸光度值。用药物组与对照组的吸光度比值来表示各药物组caspase-3和caspase-9的活化程度。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 蛋白质印迹法检测P-JNK蛋白的表达

与对照组比较，SP 3个组中P-JNK蛋白表达均显著降低（P < 0.01）。SP最小工作浓度为20 μmol/L。见图1。

2.2 倒置显微镜检测细胞凋亡的形态学变化

所有药物组细胞密度降低，细胞皱缩、变形、透明度下降，细胞质可见较大的“空泡”结构，核仁不清晰，染色质着色变深或局部凝集，联用组细胞变化最为明显。见图2。

2.3 荧光显微镜检测细胞凋亡指数

荧光显微镜下，各药物组均可观察到早期凋亡和晚期凋亡细胞。与对照组比较，所有药物组的凋亡指数均明显升高（P < 0.01），联用组凋亡指数高于Gen组、SP组（P < 0.01），但Gen组和SP组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见图3。

2.4 分光光度法检测MHCC97-L细胞caspase-3及caspase-9的活性

与对照组比较，所有药物组的caspase-3和caspase-9活性均明显升高（P < 0.01）;与Gen组、SP组比较，联用组caspase-3活性最高（P < 0.01），SP组caspase-3活性高于Gen组（P < 0.01）;联用组caspase-9活性高于Gen组（P < 0.01），SP组与Gen组、联用组与SP组caspase-9活性差异均无统计学意义（P > 0.05）。见图4。

3 讨论

JNK属于丝裂原活化蛋白激酶家族（MAPKs），由3个基因编码，JNK1和JNK2广泛表达于大多数细胞和组织，JNK3主要在心脏、大脑和睾丸中表达。JNK作为一类蛋白激酶，可被多种应激因素所激活，激活后可以磷酸化核内和胞质内的许多靶向底物，意味着JNK既可以通过核转录途径，也可以直接作用于胞质底物，如Bcl-2家族蛋白，来调节细胞的生物学效应，而且JNK在细胞增殖和细胞凋亡之间起关键的调控作用，这两种生物学效应之间的平衡，通常是由细胞环境所决定的，最终决定细胞增殖或者凋亡[14-16]。JNK介导的线粒体凋亡是由caspase-9启动的内源性凋亡途径，调控抗凋亡蛋白Bcl-2活性和促凋亡蛋白Bax和Bad转位，增加线粒体膜的通透性，导致线粒体释放细胞色素C，触发caspase-9级联反应，最终激活caspase-3[17]。

JNK在癌症发展中的作用在已报道的研究中，结果不一，显示其具有双面效应，肝癌亦是如此。一些研究支持激活JNK具有促进肝癌的作用。与癌旁肝组织比较，大约56%的肝癌组织JNK1被激活[9，18]，比较High-JNK1和Low-JNK1肝癌组织的基因表达谱确定了927个过表达的与JNK1相关的标记基因[10]。用JNK抑制剂D-JNK1处理肝癌异种移植瘤小鼠，可观察到肿瘤组织减小了一半，明确了JNK1的活性在小鼠肝癌形成后期是必需的[8]。骨髓细胞特异性JNK缺乏的小鼠表现出对肝细胞炎症和肝癌的抑制作用[19]，提示非肝實质细胞也可能作为JNK功能的位点，因此用抑制JNK的药物靶向骨髓细胞可能作为炎症性肝病的治疗方案。当肝癌细胞同时暴露于顺铂和SP时，细胞生长受到更大的抑制，细胞凋亡得到促进，提示抑制JNK通路可以增强肝癌细胞对顺铂的敏感性[20]。本研究结果显示，Gen能通过活化caspase-9和caspase-3激活线粒体凋亡通路，且抑制JNK通路可显著提升Gen的促MHCC97-L细胞凋亡作用。值得注意的是SP在上调caspase-3活性的作用中明显高于Gen（P < 0.01），虽然SP在caspase-9活性和细胞凋亡率中与Gen差异无统计学意义（P > 0.05），但是显示出略强的作用趋势。SP与联合组caspase-9活性差异无统计学意义（P > 0.05），进一步提示Gen可能主要通过JNK通路来调控caspase-9的活化水平。因此，JNK通路可能成为一个更为强效的抗肿瘤靶点。另一部分研究提供了JNK活化有抑制肝癌的证据。姜黄素衍生物WZ35可以显著抑制肝癌细胞的增殖、侵袭和迁移，并能促进Ros依赖的JNK活化，但是SP可以显著逆转WZ35引起的上述作用[21]。高车前素是一种酚类黄酮，对肝癌细胞具有抗增殖作用，激活caspase-3，诱导肝癌细胞凋亡，同样应用SP能显著抑制高车前素在肝癌细胞的抗癌作用[22]。以上实验资料支持了JNK通路在肝癌细胞增殖、凋亡、侵袭和化疗反应等方面的双重作用，这可能与细胞类型、所受的刺激因素、通路靶向信号分子的多样性、信号分子持续活化的水平和作用时间有关，因此JNK通路如何在细胞生存和细胞死亡之间做出选择，尚待深入研究。

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（收稿日期：2019-09-10  本文編辑：刘永巧）