血清蛋白生物标志物免疫学测定技术研究进展

张雪 陈艳焦 程觅

[摘要] 血清蛋白生物标志物是标记疾病过程中组织、器官或细胞功能变化的重要分子指标，在医学诊断和治疗中具有重要应用价值。酶促化学发光免疫分析、多重荧光免疫分析、电化学发光免疫分析等技术的发展为不同的血清蛋白生物标志物提供了多样的检测手段。本文对目前常用血清蛋白生物标志物检测方法的技术特点、应用研究和优势与不足进行了分析比较，为研究者选择合适的方法提供参考。

[关键词] 血清;蛋白标志物;免疫法;检测技术

[中图分类号] R446          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）12（c）-0024-06

Advance in the immunological detection technologies research of serum protein biomarkers

ZHANG Xue   CHEN Yanjiao   CHENG Mi   MAO Junxia   SHI Yanglin   YANG Yongqing   XU Yudong

Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai Research Institute of Acupuncture & Meridian， Shanghai   200030， China

[Abstract] Serum protein biomarkers are important molecular markers for labeling changes in tissues， organs and cell functions during disease， which have important application value in disease diagnosis and treatment. The development of immunological assays such as enzymatic chemiluminescence immunoassays， multiplex fluorescence immunoassays， and electrochemiluminescence immunoassays provides various methods for serum protein biomarkers detection. In this review， the technical characteristics， application research， advantages and disadvantages of the commonly used serum protein biomarker detection methods are analyzed and compared in order to provide useful reference for researchers.

[Key words] Serum; Protein biomarker; Immunological assay; Detection technologies

生物標志物是指在病理过程中，由多种因素引起的基因、组织变化，进而由细胞合成表达的某种活性物质[1]，其在体液或者细胞组织中的表达发生异常变化，对于复杂疾病的诊断和治疗具有重要意义。随着分子生物学技术的发展，越来越多的疾病相关生物标志物被发现[2]，包括DNA、RNA、蛋白质等，其中蛋白质生物标志物在医学诊断中最为常见[3]，而血清等体液样本是最重要的检测载体。蛋白物质的检测多以抗体为中心构建，因此血清蛋白生物标志物的检测在很大程度上依赖于抗体免疫技术的发展。

最早出现的免疫放射分析、酶联免疫吸附试验（ELISA）和蛋白质免疫印迹等生物标志物检测方法由于检测灵敏度和通量等方面的不足，不能很好地满足现代临床医学检测需求。近几年，在ELISA等酶免疫分析方法基础上，出现了液相悬浮芯片、微流控ELISA，以及基于流式细胞术的生物标志物测定方法，进一步提高了检测效率和信号灵敏度，开创了荧光标记免疫分析和电化学发光免疫分析的新时代。本文系统总结血清等体液样本中蛋白生物标志物免疫学测定方法的研究进展，并对这些方法的优缺点进行分析比较，为临床和基础研究中生物标志物的发现和分析提供方法学参考。

1 免疫放射分析法

1968年，Miles和Hales提出的免疫放射分析法（immunoradiometric assay，IRMA）[4]，是在放射免疫分析（radioimmunoassay，RIA）基础上建立的一种放射性同位素免疫标记测定技术。与RIA使用放射性同位素标记抗原不同的是，IRMA标记抗体，蛋白质抗体利于碘化标记且标记后的比活度高，相对提高了检测的灵敏度。IRMA将放射性同位素标记的抗体与待测样本混合后使其与目标抗原非竞争性反应结合，洗涤后测得的放射量与受检样本中目标抗原的含量呈正相关。本方法的特点是可制备放射性比活度高、稳定性好的标记抗体。有研究显示[5]，其最低检测限为0.4 U/mL，适用于分析不易得到标记抗原或标记后易失活的生物活性物质。但该方法检测浓度范围偏窄，且放射性材料会对操作人员和环境造成伤害，其应用受到较大的限制并逐渐为随后发展起来的酶免疫分析所代替。

2 酶免疫化学发光检测法

2.1 ELISA

1971年，Engvall等[6]首先提出ELISA，是建立在抗原与抗体特异性结合的基本免疫学反应原理之上，将特定抗原和抗体通过交联剂等方法用酶标记后与待测目标分子特异结合，利用酶促反应的生物放大效应，对样本中少量的生物标志物进行定性和定量分析，检测灵敏度通常在ng/mL至pg/mL的级别。根据抗原与抗体结合方式，设计出多种不同类型的检测方式，如间接法（indirect，主要用于检测抗体）、双抗体夹心法（sandwich，多用于检测抗原）和抗原竞争法（competitive，可用于检测小分子抗原或半抗原）等。其中，双抗体夹心法是最常用的方法。

由于ELISA技术成熟稳定，实验操作灵活简便，在血清蛋白生物标志物的研究中被广泛应用。在PubMed数据库中，以“ELISA”或“enzyme-linked immunosorbent assay”为关键词检索，发现近5年的相关文献5万余篇，足见其应用之广。在应用中研究者也不断尝试改进技术以提高ELISA的灵敏度和可重复性。凝血因子ⅩⅢ（FⅩⅢ）主要由A、B两个亚基构成，在血液中FⅩⅢ以非共价键的四聚体复合物（A2B2）的形式存在，FⅩⅢ四聚体检测对于凝血障碍疾病的诊断、预防和治疗具有重要意义。Katona等[7]依据FⅩⅢ四聚体的特性建立一种快速的一步夹心ELISA检测法，在血浆稀释液中加入生物素化单克隆捕获抗体（针对B亚单位）和过氧化物酶标记单克隆标记抗体（针对A亚单位），通过测定过氧化物酶活性来定量链霉亲和素包被微板上的复合物的数量。实验中只有FⅩⅢ四聚体反应，未配位的A或B亚基无反应，该测定法具有高度灵敏（可检测到正常水平1%的表达量）和良好可重复性（批间变异系数为2%～3.3%），且没有与游离的非复合物交叉反应。Dixit等[8]通过共价交联方式将单克隆抗体固化在3-氨基丙基三乙氧基硅烷功能化的微孔板表面，相对于传统ELISA方法（624 pg/mL），提高了血清胎球蛋白A的检测灵敏度（39 pg/mL）。

Schulze等[9]对比了ELISA和高效液相色谱法（HPLC）检测患者血清中不对称二甲基精氨酸（ADMA）的效能，结果显示HPLC法测定ADMA的批内、批间变异系数分别为2.5%和4.2%，且具有更高灵敏度，说明ELISA在检测灵敏度和可重复性方面存在不足。除此之外，ELISA的其他不足之处，主要体现在：①步骤复杂，需要较大血清样品量[10];②易受自身抗体或异嗜性抗体等干扰而出现假阳性结果[11];③灵敏度越高，ELISA检测结果受环境的影响相对较大，且高灵敏度常伴随着检测范围狭窄[12]。

2.2 抗体蛋白芯片检测技术

抗体蛋白芯片（antibody microarray），是将多种抗体高密度地固定到玻片或其他载体上，当样品通过芯片表面时待测抗原与芯片上的抗体特异性结合，通过读取芯片对样本中目标抗原进行定量分析。根据检测方式不同分为两种：一种是直接标记抗体芯片法，将捕获抗体预先固定在芯片载体上，对待测样品提前用生物素标记，样品与芯片反应后加入酶促化学发光底物进行信号检测。因其无需引入抗体对，避免了抗体之间可能产生的交叉反应，同时一个芯片可以检测几百甚至上千种蛋白分子，因此，适用于大批量的初步筛选试验。另一种是双抗夹心法抗体芯片，其原理类似于ELISA，检测特异性和敏感性更高，可用于目标分子的定量检测，但是由于抗体对之间可能存在的相互影响，单次检测目标分子的数量有限。

Ray等[13]利用蛋白抗体芯片从患者血浆中鉴定出18个生物标志物，与诊断结果比较，其预测阿尔茨海默症的准确率高达90%，可以对阿尔茨海默症进行分型，还可用来鉴别有轻微认知障碍的潜在患者。Wu等[14]用蛋白抗体芯片檢测系统性红斑狼疮患者血清样本，从274个因子中筛选出48个差异因子，ELISA验证结果与芯片筛选结果相符。上述研究显示，蛋白抗体芯片在疾病血清生物标志物的筛选和验证研究中具有重要的应用价值，但是该方法需要配备昂贵的芯片检测仪器，实验成本较高，另外芯片的标准难以确定，以及芯片可能存在非特异性结合，使背景信号与有效信号难以区分。

3 荧光免疫检测技术

3.1 单分子免疫检测

单分子免疫检测是随着高灵敏分析技术发展建立的一种蛋白生物标志物检测新技术[15]，可达到1000倍于ELISA的超高检测灵敏度（百分之几pg/mL），用以检测疾病早期极低丰度的血清蛋白标志物，揭示疾病相关生物标志物的微小变化。最近的一项研究中[16]，利用单分子免疫检测技术实现了对VILIP 1（visinin-like protein 1）的超高灵敏度检测，并证实VILIP 1在检测阿尔茨海默症造成的脑萎缩方面非常有效，且VILIP 1含量高低与脑体积萎缩风险呈负相关。

该技术利用毛细管进行荧光标记分子上样并使用激光聚焦进行激发，通过分析一定时间内的光信号可以对目标分子浓度进行定量。研究者利用单分子荧光光谱[17]研究DNA上解旋酶的运动[18]、RNA或蛋白质折叠，已经识别出蛋白质的结构和动态信息[19-20]。尿液中肾损伤分子-1（KIM-1）是肾小管损伤的一种敏感、特异的检测分子，Miao等[21]将夹心免疫分析和单分子免疫检测技术样品要求相结合，使用低浓度样品量化血浆中的KIM-1，检测200例心力衰竭（CHF）与60例慢性肾病（CKD）患者，结果显示该系统的KIM-1检测下限为1.4 pg/mL（报告范围为2～1000 pg/mL），血浆KIM-1在CKD和CHF患者中升高，提示KIM-1可能是肾损伤的生物标志物。虽然该方法具备超高检测灵敏度，但是单个样本只能检测一种因子，检测效率相对较低。

3.2 多重荧光免疫分析法

传统ELISA等单重分析技术所需血清样本量一般为50～100 μL[22]，检测样品数也相对有限[23]，若同时检测10个血清生物标志物的表达则可能需要多达500～1000 μL样本量和大量的检测时间，而大多数临床样本数量有限，对于ELISA实验来说样本用量和检测通量成了关键问题[24]。近年来，多重指标和中高通量筛选技术的发展，推动了血清生物标志物鉴定、验证的研究进程。多重荧光免疫分析主要包括两类：①基于微球的液相悬浮芯片分析方法，代表性的检测技术包括Luminex液相悬浮芯片检测、微流控ELISA法和流式细胞微球阵列检测法（cytometric bead array，CBA）;②基于固相芯片的多重检测，将不同的荧光标记捕获抗体固定在固相支持物上，呈点阵排列互不干扰，代表性的检测技术为Meso Scale Discovery（MSD）微阵列技术。

Fu等[38]对血清生物标志物的检测结果分析比较，认为MSD检测系统和蛋白芯片检测系统在检测限最低的情况下性能相对较好，MSD检测系统在浓度范围最宽的情况下线性信号输出最多，其量化浓度区间为（2.4～2500 ng/L），是可靠的生物标志物分析或定量的方法。Sourial等[39]比较了MSD和Luminex平台检测钙结合蛋白D28K的效能，该蛋白是肾远端小管损伤的潜在生物标志物。结果显示，MSD免疫检测系统的动态范围较宽，检测浓度最大值为500 ng/mL、最小值为50 pg/mL，而Luminex平台上该蛋白检测下限为100 pg/mL，但Luminex平台检测到的钙结合蛋白D28K含量几乎是MSD的10倍，出现这一结果的原因是Luminex将捕获抗体固定在微球上可以提供比MSD板底部更大的总表面，因而具有更高的检测率。Dabitao等[40]用MSD和CBA两种方法检测人类免疫缺陷病毒（HIV）感染者和未感染者血清樣本中多种细胞因子水平。从标准曲线分析，MSD系统的灵敏度略高于CBA，且MSD平台能够量化检测内源性IL-12 p70，TNF-α和IL-10的表达水平，但是CBA却无法检测到这些因子。通过添加特定浓度细胞因子重组蛋白，分析两种方法的实测浓度和批间差异评价回收率和准确性，发现MSD优于CBA。因此相对于CBA来说，MSD对HIV感染个体血清促炎细胞因子测定更可靠准确。

5 总结与展望

血清等体液样本中蛋白生物标志物的筛选和定量分析是医药领域的一个重要研究课题，随着基因组学、蛋白质组学、代谢组学及生物信息学等生物技术的发展，疾病相关生物标志物的数量不断增长。为了充分发挥血清蛋白生物标志物的在诊断、预防和治疗等方面的应用价值，开发高特异性、高灵敏度、高通量的检测方法显得极为重要。以ELISA为代表的酶免疫分析法具有高特异性和灵活性，以单分子检测技术为代表的超高检测灵敏度，以液相悬浮芯片为代表的高通量检测技术为不同的血清蛋白生物标志物提供了丰富多样的检测手段，拓展了其在基础医学、转化医学和临床医学中的应用。不同检测方法在具体应用时，低灵敏度和高灵敏度检测、单样本检测和多重检测各有利弊，研究者要根据自己的样本消耗量、生物标志物种类、丰度高低的动态范围等因素进行比较和验证，选用合适的方法。目前，血清蛋白生物标志物测定在实际操作中还没有统一规范的检测标准，在抗原的均一性、抗体的稳定性、检测方法的重复性与灵敏度等方面还存在诸多问题。因此，同时兼顾高特异性、高灵敏度、高通量、低成本和易操作性将是未来开发血清蛋白生物标志物检测技术的新目标与新方向。随着生物科学技术的进步，现有的免疫学测定技术会更加完善，新的方法也会不断创新与运用，血清蛋白生物标志物的研究和应用进程会进一步加快。

[参考文献]

[1]  熊凯，薛丽香.基因组学与表观遗传学在肿瘤标志物研究中的应用[J].中国生物化学与分子生物学报，2014，30（1）：30-37.

[2]  虞萌，黄家恺，巴俊强，等.生物标志物的筛查方法及研究进展[J].医学综述，2017，23（5）：867-871.

[3]  Brentnall TA，Pan S，Chen R，et al. Multiplex targeted proteomic assay for biomarker detection in plasma：a pancreatic cancer biomarker case study [J]. J Proteome Res，2012，11（3）：1937-1948.

[4]  王博诚.免疫放射分析法[J].国际放射医学核医学杂志，1986.

[5]  燕强奋，梁瑞鹏，王衍真，等.人血清CA15-3免疫放射分析法的建立[J].同位素，2004，17（2）：74-78.

[6]  Engvall E，Perlmann P. Enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA），Quantitative assay of immunoglobulin G [J]. Immunochemistry，1971，8（9）：871-874.

[7]  Katona V，Haramura G，Karpati L，et al. A simple，quick one-step ELISA assay for the determination of complex plasma factor Ⅻ（A2B2）[J]. Haemost，2000，83（2）：268-273.

[8]  Dixit CK，Vashist SK，O′Neill FT，et al. Development of a high sensitivity rapid sandwich ELISA procedure and its comparison with the conventional approach [J]. Anal Chem，2010，82（16）：7049-7052.

[9]  Schulze F，Schwedhelm E，Maas R，et al. Comparison of HPLC method and commercial ELISA assay for asymmetric dimethylarginine（ADMA） determination in human serum [J]. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2005，828（1）：97-102.

[10]  Datta SC，Opp MR. Lipopolysaccharide-induced increases in cytokines in discrete mouse brain regions are detectable using Luminex xMAP technology [J]. J Neurosci Methods，2008，175（1）：119-124.

[11]  吳玉红.ELISA法检测HBsAg出现假阳性的原因探讨[J].中国现代医生，2010，48（19）：81-82.

[12]  公爱娟，刘春娟，辛杰，等.酶联吸附免疫法和胶体金免疫色谱技术在中药黄曲霉毒素检测中的应用进展[J].中草药，2018，49（9）：2195-2202.

[13]  Ray S，Britschgi M，Herbert C，et al. Classification and prediction of clinical Alzheimer′s diagnosis based on plasma signaling proteins [J]. Nat Med，2007，13（11）：1359-1362.

[14]  Wu TF，Ding HH，Han J，et al. Antibody-array-based proteomic screening of serum markers in systemic lupus erythematosus：a discovery study [J]. J Proteome Res，2016，15（7）：2102-2114.

[15]  Smith L，Kohli M，Smith AM. Expanding the dynamic range of fluorescence assays through Single-Molecule Counting and intensity calibration [J]. J Am Chem Soc，2018，140（42）：13 904-13 912.

[16]  Sutphen CL，Jasielec MS，Shah AR，et al. Longitudinal cerebrospinal fluid biomarker changes in preclinical alzheimer disease during middle age [J]. JAMA Neurol，2015，72（9）：1029-1042.

[17]  Ha T，Enderle T，Ogletree DF，et al. Probing the interaction between two single molecules：fluorescence resonance energy transfer between a single donor and a single acceptor [J]. Proc Natl Acad Sci U S A，1996，93（13）： 6264-6268.

[18]  Myong S，Rasnik I，Joo C，et al. Repetitive shuttling of a motor protein on DNA [J]. Nature，2005，437（7063）：1321-1325.

[19]  Keller BG，Kobitski A，J？覿schke A，et al. Complex RNA folding kinetics revealed by single-molecule FRET and hidden Markov models [J]. J Am Chem Soc，2014，136（12）：4534-4543.

[20]  Schuler B，Lipman EA，Eaton WA. Probing the free-energy surface for protein folding with single-molecule fluorescence spectroscopy [J]. Nature，2002，419（6908）：743-747.

[21]  Miao J，Friedman E，Wu AHB，et al. Clinical utility of single molecule counting technology for quantification of KIM-1 in patients with heart failure and chronic kidney disease [J]. Clin Biochem，2017，50（16-17）：889-895.

[22]  T？觃rnok A. Cytometric bead array to measure six cytokines in twenty-five microliters of serum [J]. Clin Chem，2003， 49（6）：1000-1002.

[23]  Breen EC，Reynolds SM，Cox C，et al. Multisite comparison of high-sensitivity multiplex cytokine assays [J]. Clin Vaccine Immunol，2011，18（8）：1229-1242.

[24]  Morgan E，Varro R，Sepulveda H，et al. Cytometric bead array：a multiplexed assay platform with applications in various areas of biology [J]. Clin Immunol（Orlando），2004， 110（3）：252-266.

[25]  Mcdade RL，Spain MD. Rapid，economical testing in the clinical laboratory：A new flow cytometry-based multiplex system [J]. Clin Immunol Newslett，1997，17（10-11）：0-158.

[26]  Vignali DA. Multiplexed particle-based flow cytometric assays [J]. J Immunol Methods，2000，243（1）：243-255.

[27]  Tan CY，Immermann FW，Sebastian S，et al. Evaluation of a validated luminex-based multiplex immunoassay for measuring immunoglobulin G antibodies in serum to pneumococcal capsular polysaccharides [J]. mSphere，2018，3（4）：e00127-18.

[28]  Lucas JL，Tacheny EA，Ferris A，et al. Development and validation of a Luminex assay for detection of a predictive biomarker for PROSTVAC-VF therapy [J]. PLoS One，2017，12（8）：e0182739.

[29]  Houser B. Bio-Rad′s Bio-PlexA suspension array system，xMAP technology overview [J]. Arch Physiol Biochem，2012，118（4）：192-196.

[30]  Salieb-Beugelaar GB，Simone G，Arora A，et al. Latest developments in microfluidic cell biology and analysis systems [J]. Anal Chem，2010，82（12）：4848-4864.

[31]  Aldo P，Marusov G，Svancara D，et al. Simple Plex：A novel multi-analyte，automated microfluidic immunoassay platform for the detection of human and mouse cytokines and chemokines [J]. Am J Reprod Immunol，2016，75（6）：678-693.

[32]  Gupta V，Davancaze T，Good J，et al. Bioanalytical qualification of clinical biomarker assays in plasma using a novel multi-analyte Simple PlexTM platform [J]. Bioanalysis，2016，8（23）：2415-2428.

[33]  Agache I，Strasser DS，Klenk A，et al. Serum IL-5 and IL-13 consistently serve as the best predictors for the blood eosinophilia phenotype in adult asthmatics [J]. Allergy，2016，71（8）：1192-1202.

[34]  Carson RT，Vignali DA. Simultaneous quantitation of 15 cytokines using a multiplexed flow cytometric assay [J]. J Immunol Methods，1999，227（1-2）：41-52.

[35]  Young SH，Antonini JM，Roberts JR，et al. Performance evaluation of cytometric bead assays for the measurement of lung cytokines in two rodent models [J]. J Immunol Methods，2008，331（1-2）：59-68.

[36]  陸龙飞，葛胜祥，张军.化学发光免疫分析法研究进展[J].分子诊断与治疗杂志，2015，7（5）：289-295.

[37]  Burguillos MA. Use of meso-scale discoveryTM to examine cytokine content in microglia cell supernatant [J]. Methods Mol Biol，2013，1041：93-100.

[38]  Fu Q，Zhu J，Van Eyk JE. Comparison of multiplex immu-noassay platforms [J]. Clin Chem，2010，56（2）：314-318.

[39]  Sourial S，Marcusson-Stahl M，Cederbrant K. Meso scale discovery and luminex comparative analysis of calbindin D28K [J]. J Biomed Biotechnol，2009，2009：187 426.

[40]  Dabitao D，Margolick JB，Lopez J，et al. Multiplex measurement of proinflammatory cytokines in human serum：comparison of the Meso Scale Discovery electrochemiluminescence assay and the Cytometric Bead Array [J]. J Immunol Methods，2011，372（1-2）：71-77.

（收稿日期：2019-09-06  本文编辑：刘明玉）