UPLC-ESI-MS／MS 法同时测定胡黄连中4 种环烯醚萜

王知斌， 李 凯， 高 岩， 孙延平， 孟永海， 杨炳友， 匡海学

（黑龙江中医药大学，教育部北药基础与应用研究重点实验室，黑龙江中药天然药物药效物质基础研究重点实验室，黑龙江 哈尔滨150040）

胡黄连为玄参科植物胡黄连Picrorrhiza scrophularaeflora Pennell 的干燥根茎，发现于西藏东南部和云南西北部海拔4 400 m 以上的地区，味苦性寒，归肝、胃、大肠经，具有退虚热、除疳热、清湿热等功效［1-2］。胡黄连中主要含有环烯醚萜类、酚苷类、苯乙醇苷类，环烯醚萜类为其主要活性和特征性成分［3］，现代药理学研究表明，胡黄连具有保肝、抗炎、抗哮喘、神经保护、免疫活性、降血糖等活性，在临床上应用广泛［4-9］。2015 年版《中国药典》 规定了胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ的总含有量不得低于9%［10］，并未对其他成分做出要求。在使用HPLC 分析胡黄连中环烯醚萜类成分含有量的过程中发现，胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅲ的出峰时间一致二者未分离。而液质联用技术结合了色谱对复杂样品的高分离能力和MS 的高选择性、高灵敏度能有效的将二者分离。目前有关胡黄连苷Ⅰ或胡黄连苷Ⅱ单一成分含有量测定的报道较多［11-12］，但关于胡黄连苷Ⅲ、獐牙菜苷的研究未见报道［13］。因此本研究建立UPLC-ESI-MS／MS 法以芍药苷为内标物同时测定胡黄连中胡黄连苷Ⅰ、胡黄连苷Ⅱ、胡黄连苷Ⅲ、獐牙菜苷的含有量，以期应用到胡黄连的质量控制。

1 材料

AcquityTMUPLC 型超高液相色谱仪 （美国Waters 公司）；4000 QTRAPTM质谱仪 （美国AB Sciex 公司）；Milli-Q 超纯水制备仪（美国Milipore公司）；NewClassic MF 电子分析天平（十万分之一，美国Mettler-toledo 公司）。

22 批胡黄连药材采购于西藏 （XZ）、 四川（SC）、云南（YN）、甘肃（GS）、北京（BJ）、安徽（AH） 等地，经黑龙江中医药大学中药资源教研室苏连杰教授鉴定为正品。胡黄连苷I、胡黄连苷Ⅱ、胡黄连苷Ⅲ、獐牙菜苷对照品、内标芍药苷（含有量≥99%） 购于南京景竹生物科学有限公司。色谱级乙腈（美国Dikama 公司）；Milli-Q 超纯水（自制）；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 ACTUITY UPLC® BEH Amide 色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流动相0.1%甲酸-乙腈（8 ∶92）；体积流量0.4 mL／min；柱温40 ℃；进样量2 μL。

2.2 质谱条件 电喷雾离子源（ESI）；负离子模式；多反应监测模式 （MRM）； 源喷射电压-4 500 V； 离 子 源 温 度 450 ℃； 雾 化 气379.225 kPa；加热气379.225 kPa；全程通入氮气。4 个化合物及内标的检测离子对，去簇电压（DP），碰撞能（CE），见表1。

表1 负离子模式下分析物和内标Tab.1 MRM conditions of analyte and internal standard in negative ion mode

2.3 溶液制备

2.3.1 对照品溶液 精密称定胡黄连苷Ⅰ、胡黄连苷Ⅱ、胡黄连苷Ⅲ、獐牙菜苷和内标（芍药苷）对照品适量，分别置于10 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，配制成1.528 mg／mL 胡黄连苷Ⅰ、1.154 mg／mL 胡黄连苷Ⅱ、1.120 mg／mL 胡黄连苷Ⅲ、1.006 mg／mL 獐牙菜苷和1.054 mg／mL 内标对照品贮备液。再精密吸取适量各对照品贮备液，加入同一量瓶中，用甲醇稀释定容，配制为系列混合标准溶液，各系列混合标准溶液含胡黄连苷Ⅰ（15.28、22.92、45.84、76.40、152.8、305.6 ng／mL）；胡黄连苷 Ⅱ （11.54、 17.31、 34.62、 57.70、 115.4、230.8 ng／mL）；胡黄连苷Ⅲ（11.20、16.80、33.60、56.00、112.0、224.0 ng／mL）；獐牙菜苷（10.06、15.09、30.18、 50.30、 100.6、 201.2 ng／mL）， 上述溶液均保存于4 ℃冰箱备用。

2.3.2 供试品溶液 胡黄连干燥根茎药材粉碎（过40 目筛），精密称取0.1 g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率250 W，频率33 kHz） 30 min，待冷却至室温后再称定质量，用甲醇补足减失质量，摇匀，过滤后取续滤液1 mL 于5 mL 量瓶中，加甲醇定容，取适量经12 000 r／min 离心10 min，取上清液过0.22 μm 微孔滤膜，即得。

2.4 专属性试验 图1 表明，被测定成分间分离度良好，无杂质干扰，供试品溶液中的胡黄连苷Ⅰ、胡黄连苷Ⅱ、胡黄连苷Ⅲ、獐牙菜苷和芍药苷的 保 留 时 间 分 别 为1.54、 2.09、 2.03、 1.66、1.74 min，与对照品一致，比较供试品溶液和对照品的母离子、子离子质谱图，两者一致，表明本法专属性良好。

图1 各成分UPLC-ESI-MS／MS 图谱Fig.1 UPLC-ESI-MS／MS spectra of various constituents

2.5 线性关系考察 精密吸取“2.3.1” 项下的各系列混合对照品溶液适量，再分别加入一定量的内标溶液，制得系列浓度线性工作液，取2 μL，在“2.1” “2.2” 项条件下进样。以各分析物的色谱峰面积和内标峰面积的比值为纵坐标（Y）、以各分析物质量浓度为横坐标（X） 进行回归，结果见表2。表明各成分在各自范围内线性关系良好。

表2 各成分线性关系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.6 精密度试验 取同一批次的供试品溶液，按“2.3.2” 项下方法每天制备6 份供试品溶液，连续3 d，在“2.1” “2.2” 项条件下进样，测得胡黄连苷I、胡黄连苷Ⅱ、胡黄连苷Ⅲ和獐牙菜苷含有 量 RSD 分 别 为 1.93%、 1.96%、 2.08%、2.02%，表明仪器精密度良好。

2.7 重复性试验 取同一批次的胡黄连药材样品，按“2.3.2” 项下方法制备6 份供试品溶液，在“2.1” “2.2” 项条件下进样，测得胡黄连苷I、胡黄连苷Ⅱ、胡黄连苷Ⅲ和獐牙菜苷含有量RSD 分别为3.90%、4.21%、3.09%、3.25%，表明该方法重复性良好。

2.8 稳定性试验 取同一批次的胡黄连药材样品，按“2.3.2” 项下方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、10、12、24 h，在“2.1” “2.2” 项条件下进样，测得胡黄连苷Ⅰ、胡黄连苷Ⅱ、胡黄连苷Ⅲ和獐牙菜苷峰面积RSD 分别为2.92%、3.20%、3.81%、4.15%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.9 加样回收率试验 精密称取已知含有量的供试品粉末9 份，每份约0.05 g，按高、中、低分为3 组，分别精密加入一定量的混合对照品溶液，按“2.3.2” 项下方法平行制备供试品溶液， 在“2.1” “2.2” 项条件下进样，并计算加样回收率，结果见表3。

表3 各成分加样回收率试验结果（n＝9）Tab.3 Results of recovery tests for various constituents（n＝9）

2.10 样品含有量测定 取22 个不同批次样品，分别按 “2.3.2” 下方法制备供试品溶液。 在“2.1” “2.2” 项条件下进样，采用内标法，根据标准曲线计算22 批样品中胡黄连苷Ⅰ、胡黄连苷Ⅱ、胡黄连苷Ⅲ和獐牙菜苷的含有量， 结果见表4。

表4 各成分含有量测定结果（mg／g）Tab.4 Results of content determination of various constituents（mg／g）

3 讨论

本实验以胡黄连苷Ⅰ、胡黄连苷Ⅱ、胡黄连苷Ⅲ和獐牙菜苷作为含有量测定指标，对不同产地的胡黄连含有量测定方法进行研究，包括供试品溶液制备方法、液相色谱条件选择、含有量测定方法学验证等，确定了胡黄连的含有量测定方法［12］。结果表明该方法简便可行，且有较好的准确性和精密度。

本实验首次建立了UPLC-ESI-MS／MS 法同时测定不同批次的胡黄连中胡黄连苷Ⅰ、胡黄连苷Ⅱ、胡黄连苷Ⅲ和獐牙菜苷的含有量。 解决了HPLC 法中胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅲ的分离度较差的问题。不同批次的胡黄连药材中4 种环烯醚萜类的含有量差异较大，部分从甘肃、四川、云南、西藏等地网购的批次质量不达标，市场上的胡黄连良莠不齐。